какой метод окраски используется для выявления жгутиков
Методы выявления капсул, жгутиков, спор
Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.
2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.
3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.
5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.
6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Выявление капсулы по методу Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.
Окраска жгутиков по Леффлеру:
1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.
2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).
3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Изучение микробов в живом состоянии
Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.
Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Простые методы окраски микробов.
2. Сложные методы окраски микробов.
3. Сущность окраски микробов по Граму.
4. Техника окраски микробов по Граму.
5. Структура бактериальной клетки.
6. Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор.
7. Методы изучения микробов в живом состоянии.
Литература для подготовки к занятию:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.
Какой метод окраски используется для выявления жгутиков
Жгутики бактерий очень тонки и легко отрываются. Поэтому обнаружить их можно только при специальной окраске или с помощью электронного микроскопа.
Выявить жгутики у бактерий, применив обычные способы окраски анилиновыми красителями невозможно.
Жгутики, как правило, становятся видимы, если препарат предварительно обработать протравой, а потом окрасить. Протравленный препарат легче воспринимает окраску, но самое главное то, что жгутики при осаждении на них протравы увеличиваются и становятся видимыми при микроскопировании.
Существуют разные способы окраски жгутиков, но в каждом отдельном случае в зависимости от индивидуальных свойств микробов приходится выбирать тот или иной способ.
Для успешной окраски жгутиков должны соблюдаться следующие условия:
1. Чистота предметных и покровных стекол должна быть идеальной.
2. Препарат должен готовиться из свежей агаровой суспензии культуры не старше суточной, а для некоторых видов (вибрион, сенная палочка) не старше 12 часов. Часть материала, взятую из посевной черты (ближе к конденсационной воде), где больше влаги переносят в пробирку с 1 – 2 мл стерильной водопроводной воды. Пробирки выдерживают 30 60 минут при комнатной температуре, затем взвесь бактерий переносится в каплю стерильной водопроводной воды или физиологического раствора, нанесенную на покровное стекло. При распределении материала на покровном стеклышке, надо соблюдать осторожность, чтобы механически не повредить жгутики инее оторвать их от тела бактерий.
Мазок должен быть тонким, чтобы особи могли расположиться изолировано друг от друга.
Воду на стекле следует распределять тонким слоем, чтобы ускорить высыхание препарата и уменьшить потерю жгутиков.
Наиболее часто для окрашивания жгутиков используют способ Леффлера (Loffler). Методика окраски:
1. На высушенный и зафиксированный мазок наливают протраву в таком количестве, чтобы покрыть всю поверхность покровного стеклышка, и выдерживают 3 – 5 минут при комнатной температуре.
2. По истечении указанного времени препарат осторожно и тщательно промывают проточной водой.
3. На препарат наносят раствор фуксина (1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10 частей воды) и препарат прогревают над пламенем до появления пара.
4. Препарат промывают водой и микроскопируют.
Приготовление протравы для выявления жгутиков бактерий:
12г танина растворяют при нагревании в 48 мл воды и к этому раствору прибавляют 30 мл насыщенного раствора фуксина в 95% этиловом спирте. Раствор отфильтровывают и хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой. Протрава готова к употреблению через несколько дней после приготовления и может сохраняться в течение нескольких месяцев.
Для обнаружения жгутиков у простейших препараты можно окрашивать простым способом, используя метиловый синий, раствор Люголя или сложным методом по Романовскому – Гимза.
Выявление капсул у бактерий
Капсулы не обладают выраженным сродством к основным красителям, поэтому для обнаружения капсул применяют различные способы приготовления микропрепаратов и их окраски, учитывая особенности образования и сохранения капсул у разных видов бактерий.
Для обнаружения капсулы необходимо наличие окрашенного внутри капсулы фона и окрашенного наружного фона.
Внутренний фон представлен окрашенной микробной клеткой, находящейся внутри капсулы. А наружный фон, окружающий капсулу, может быть естественным или искусственным.
Если микроб сохраняет капсулу постоянно, т.е. не только внутри макроорганизма, но и на питательной среде (клебсиеллы), то препарат для обнаружения капсул можно приготовить из культуры, выращенной in vitro на питательной среде. И в таком случае наружный фон создается искусственно.
Если микроб образует и сохраняет капсулу только внутри макроорганизма (возбудители сибирской язвы, чумы, пневмококки), то в таком случае делается мазок – отпечаток из пораженного органа погибшего макроорганизма (из печени, селезенки, лимфатических узлов) или из мокроты, содержимого бубона, крови. Наружный фон капсулы будет представлен тканевыми клетками.
В том случае, если микропрепарат готовится из исследуемого материала, мазок может быть окрашен одним анилиновым красителем, по методу Грамма, по методу Романовскго – Гимза. В каждом из этих трех споосбов окраски на фоне окрашенных тканевых клеток, будет видна бесцветная капсула, окружающая окрашенную микробную клетку. Обнаружение спор.
Благодаря толщине свое оболочки и плотности содержимого, споры остаются неокрашенными при обработке препарата анилиновыми красителями простым методом или сложным по Граму.
При окраске по Граму или по Леффлеру спора внутри окрашенной цитоплазмы микробной клетки выглядит как зернышко круглой или овальной формы, сильно преломляющее свет.
Существует несколько методов окраски спор (по Циль – Нильсену, по Ганзену, по Ожешко и др.) позволяющих достигнуть контрастной окраски спор в цитоплазме.
Методика окраски микропрепарата:
1) На фиксированный препарат накладывается полоска фильтровальной бумаги (для защиты препарата от оседающих кристаллов красителя) и на нее наливается карболовый фуксин Циля. Препарат осторожно прогревается в течение 3 – 4 минут над пламенем горелки. По мере испарения жидкости краситель добавляется.
2) Фильтровальная бумага снимается и на мазок наносится 2 – 3 капли 5% раствора кислоты (серной, соляной, азотной или уксусной) на 30 секунд.
3) Препарат тщательно промывается струей холодной воды и высушивается.
4) Докрашивается раствором метиленовой сини Леффлера в течение 1 – 2 минут.
5) Препарат промывается струей воды, высушивается и микроскопируется. На голубом фоне цитоплазмы видны сиренево – красные споры.
Этот метод позволяет обнаружить споры не только в процессе их формирования внутри клетки, но и после того как сформированная спора высыпалась из разрушившейся микробной клетки.
Приготовление карболового фуксина Циля:
10 мл. насыщенного спиртового раствора фуксина растворяют в 100 мл 5% раствора карболовой кислоты.
Обнаружение зерен волютина
Зерна волютина (запасные вещества полифосфатной природы) можно обнаружить в клетках многих микроорганизмов.
У бактерий и актиномицетов гранулы волютина располагаются в цитоплазме, у дрожжей и грибов – в вакуолях. Как правило, зерен волютина больше в молодых клетках.
В неокрашенном состоянии крупные зерна волютина выделяются от остальной плазмы большей светопреломляемостью.. Однако лучше наличие зерен волютина определяется в окрашенных препаратах. Для обнаружения зерен волютина применяется окраска метиловой синью по Леффлеру. Зерна волютина при этом окрашиваются в сине – фиолетовый цвет, а протоплазма – в голубой.
Дифференциальная окраска зерен волютина может быть достигнута различными способами окраски, в том числе и способом Нейссера (Neisser). Нейссер разработал и предложил для выявления зерен волютина в клетках дифтерийных бактерий.
При окраске по способу Нейссера зерна волютина окрашиваются в синий или темно – коричневый цвет, а протоплазма – в светло – коричневый.
Зерна волютина можно выявить окраской по способу Омелянского. Для этого на фиксированный мазок наливают карболовый фуксин Циля на 30 секунд. После чего краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 30 – 40 секунд 1% раствором серной кислоты. Затем кислоту сливают, препарат промывают водой и докрашивают метиловым синим в разведении 1:40 в течение 30 секунд. После промывки водой препарат высушивают и микроскопируют.
Зерна волютина при этом способе окраски окрашиваются в сиренево – красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы.
При окраске препарата по методу Грама зерна волютина по тональности и интенсивности окраски не дифференцируются от цитоплазмы, поэтому окраску по методу Грама для выявления зерен волютина применять не имеет смысла.
У некоторых микроорганизмов запасные вещества накапливаются в виде гранул углеводной природы. Их можно выявить при обработке клеток раствором Люголя. Гранулы крахмалоподобных веществ окрашиваются в синий, а гранулы гликогеноподобных полисахаридов – в красновато – коричневый цвет.
Окрашивание микропрепаратов из исследуемого материала
Микропрепараты из крови окрашивают по Романовскому – Гимза, фуксином, метиловым синим или другими анилиновыми красителями.
Для наблюдения вегетативных стадий кишечных простейших пользуются прижизненной окраской паразитов раствором Люголя, слабыми растворами основных красителей (эозин, метиловый синий и др.) в разведении 1:1000 и даже 1: 10000. Для более подробного изучения паразитов, препараты фиксируют жидкими фиксаторами (жидкость Шаудина, метиловый или этиловый спирт) и окрашивают гематоксилином, метиловым синим, фуксином, краской Романовского.
Фиксированные микропрепараты из гнойного содержимого язв, пунктатов бубонов, лимфатических узлов в зависимости от предполагаемого возбудителя окрашивают по Граму, по Бури, по Романовскому – Гимза, серебрением по Морозову.
2.5. Методы окраски жгутиков бактерий
Жгутики микроорганизмов — тончайшие образования (0,02 — 0,04 мкм), легко отрывающиеся от клетки при обработке. Это затрудняет их исследование. В основе методов окрашивания жгутиков лежит обработка их протравителями, в результате которой они увеличиваются в объеме.
Подготовка материала. Для подготовки культуры рекомендуется ежедневно несколько дней подряд делать пересевы на свежую питательную среду (в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованой среды). В день просмотра материал берут петлей и переносят в пробирку с 5 — 6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37 0 С. Не рекомендуется размешивать бактериальную массу в воде петлей, она сама должна разойтись в ней в течение 30 — 60 мин. Прежде чем приступать к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1 1 /2 — 2 сут.
Для приготовления препаратов необходимы абсолютно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке с 96%-ным спиртом. Затем ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, сильно нагревают и охлаждают.
2.5.1. Окраска жгутиков по методу Леффлера
Суспензию 12 — 16-часовой культуры бактерий наносят на предметное стекло и сушат при комнатной температуре. Допустимо зафиксировать мазок, быстро проведя его через пламя. Далее препарат обрабатывают протравителем 3 — 5 мин (способ 1) или 30-50 сек (способ 2), нагревая его до появления паров или в течение 15 — 20 мин при комнатной температуре, затем промывают сильной струей дистиллированной воды 30 с и высушивают на воздухе. Далее окрашивают препарат 3 — 4 мин карболовым фуксином Циля или раствором, содержащим 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды при легком нагревании до появления пара. Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют под микроскопом с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.
Приготовление протравителя (готовят за 1-2 суток перед использованием):
способ 1: 12 г таннина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенного водного раствора железного купороса (FeSO4) и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-ном спирте. Смесь готовят за несколько дней до использования, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте (в таких условиях может храниться несколько месяцев). Перед началом работы смесь фильтруют;
способ 2: смешивают 20%-ный водный раствор таннина, 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 5,5 мл насыщенного на холоду водного раствора сульфата закисного железа (соль Мора). Фильтруют перед использованием.
2.5.2. Метод серебрения жгутиков по Морозову
Готовят три реактива.
Состав первого: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды;
состав второго: 5 г таннина, 1 мл жидкой карболовой кислоты (фенола), 100 мл дистиллированной воды;
состав третьего: 5 г кристаллического нитрата серебра (AgNO3), 100 мл дистиллированной воды; отливают 20 мл в другой сосуд, а к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям приливают водный раствор аммиака (нашатырного спирта) до растворения образовавшегося осадка и появления легкой опалесценции. Если аммиака будет добавлено слишком много, то из оставшихся 20 мл раствора серебра следует добавить еще несколько капель до возникновения опалесценции.
Для окраски препарата полученный раствор серебра разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100.
на 1 мин на препарат наливают первый реактив, сливают его, промывают препарат водой;
наливают второй реактив, препарат подогревают на слабом пламени 1 мин до появления паров, тщательно промывают водой;
при нагревании обрабатывают препарат 1 — 2 мин третьим реактивом до появления темно-коричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.
Методы выявления капсул, жгутиков, спор
Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.
2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.
3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.
5. Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.
6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Выявление капсулы по методу Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.
Окраска жгутиков по Леффлеру:
1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.
2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).
3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Изучение микробов в живом состоянии
Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.
Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.
Контрольные вопросы по теме занятия:
1. Основные структурные элементы бактериальной клетки, их функции.
2. Особенности строения клеточной стенки. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
3. Спорообразование у бактерий.
4. Включения в цитоплазму бактериальной клетки.
5. Простые методы окраски микробов.
6. Сложные методы окраски микробов (методы Грама, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Ожешко). Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор бактерий.
7. Сущность окраски микробов по Граму.
8. Техника приготовления мазков на предметных стеклах. Техника приготовления двух и более мазков на одном стекле.
9. Техника окраски микробов по Граму. Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму.
10. Методы изучения микробов в живом состоянии.
Литература для подготовки к занятию:
Основная литература:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.
Дополнительная литература:
1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.
Ультраструктура бактериальной клетки
1. Нуклеоид – генетический аппарат бактерий. Содержит ДНК, РНК, белки (отсутствуют мембрана, гистоны, не делится митозом).
— рибосомы – место синтеза белка;
— плазмиды – автономная молекула ДНК с дополнительной генетической информацией (способность к конъюгации, резистентность к лекарственным препаратам, синтез токсинов и др.);
— включения (волютин, гликоген, крахмал, сера) – запас питательных веществ.
4. Мезосомы – производные (впячивания) цитоплазматической мембраны (ламинарные, везикулярные, трубчатые); функция – участие в делении клетки и в секреции веществ.
5. Клеточная стенка – структура, придающая бактериям постоянную определенную форму. Основа – пептидогликан (параллельно расположенные поперечные молекулы гликана, соединенные тетрапептидом). У грамположительных бактерий пептидогликан многослойный, прошит тейхоевой и липотейхоевой кислотами. У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослойный, связан с помощью липопротеина с наружной мембраной, состоящей из липополисахаридов, фосфолипидов и белков.
6. Жгутики – тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, аппарат передвижения: монотрихи, амфитрихи, лофотрихи, перитрихи (аэротаксис, фототаксис). Состав – белок флагеллин (Н-антиген). Обнаруживаются при окраске по Леффлеру.
7. Пили (ворсинки, фимбрии) – нитевидные образования, берущие начало от поверхности клетки:
— пили первого типа – общие пили (100-200), адгезивные;
— пили второго типа – конъюгативные (половые) пили (1-4).
Состав – белок пилин.
8. Капсула (макрокапсула, слизистый чехол, микрокапсула). Химическое строение – полисахарид. Образуется главным образом в макроорганизме. Защищает бактерии от факторов макроорганизма. Определяет типоспецифичность бактерий. Обнаруживается при окраске по Бурри-Гинсу.
9. Спора – форма сохранения вида в неблагоприятных условиях. Не является способом размножения. Место расположения в клетке – центральное, субтерминальное, терминальное. Обнаруживаются при окраске по методу Ожешки (Цилю-Нильсену).
ЗАНЯТИЕ 3
ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Стерилизация. Методы стерилизации. Дезинфекция. Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизм их антибактериального действия. Физиология бактерий. Питание микроорганизмов. Питательные среды, их классификация. Техника посева в жидкие и на плотные питательные среды. Бактериологический метод (первый этап).
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Изучить действие физических и химических факторов на микроорганизмы. Ознакомиться с методами стерилизации и дезинфекции. Познакомиться с основными группами дезинфицирующих и антисептических веществ, механизмами их антибактериального действия. Познакомиться с понятием “физиология бактерий”, типами питания микроорганизмов, классификацией питательных сред. Освоить технику посева бактерий в жидкие и на плотные питательные среды.
ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:
1. Изучить действие физических и химических факторов на микроорганизмы.
2. Ознакомиться с методами стерилизации и дезинфекции.
3. Изучить основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизмы их антибактериального действия.
4. Познакомиться с типами питания микроорганизмов и с классификацией питательных сред.
5. Освоить технику посева бактерий в жидкие и на плотные питательные среды.
Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Принципы методов выявления капсул, жгутиков, спор
Тема: Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Принципы методов выявления капсул, жгутиков, спор.
1. Простые и сложные методы окраски микробов
Наиболее часто для изучения бактерий применяют микроскопирование препаратов, приготовленных из исследуемого инфицированного материала. Для этого препараты высушивают, фиксируют и окрашивают специальными красителями. Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.
Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.
Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Наибольшее распространение получил метод окраски по Граму.
1. На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наносят раствор генцианового фиолетового. Через 2-3 минуты бумагу снимают, а остатки красителя сливают.
2. На препарат наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.
3. На препарат наносят этиловый спирт на 30-60 секунд.
4. Препарат промывают водой.
5. Мазок докрашивают раствором фуксина в течение 1-2 минут.
6. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.
При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют заранее приготовленные полоски фильтровальной бумаги, пропитанные генциановым фиолетовым и высушенные. На фиксированный мазок помещают приготовленную бумажку, наливают небольшое количество воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают остатки красителя и наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят описанным способом.
Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:
1. Грамположительные бактерии:
— бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);
— микобактерии, коринебактерии и листерии.
2. Грамотрицательные бактерии:
— остальные палочковидные бактерии;
— извитые формы (спириллы, спирохеты).
2. Структура бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки подразделяются на 2 вида:
— основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и включениями, нуклеоид);
— временные структуры (капсула, жгутики, ворсинки, эндоспоры).
Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Функции клеточной стенки:
— защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;
— определение формы бактерий;
— участие в метаболизме бактерий;
— токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);
— наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).
Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана, пронизанного молекулами тейхоевых кислот. Пептидогликан – это многослойный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.
Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой образован тонким слоем пептидогликана. Пептидогликан располагается в периплазматическом пространстве. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана) состоит из липополисахарида, белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахарид грамотрицательных бактерий обладает токсическими свойствами и называется эндотоксином. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий неплотно прилегает к цитоплазматической мембране.
У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.
ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:
— избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;
— превращение клеточной энергии;
— репликация и последующее разделение хромосомы.
В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом.
Цитозоль – это гомогенная фракция, включающая РНК, ферменты, продукты метаболизма.
К структурным элементам цитоплазмы относятся рибосомы, включения и нуклеоид.
Рибосомы – это органоиды, которые представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.
Временные структуры образуются у некоторых бактериальных клетках или формируются в определенных условиях существования. К ним относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.
— место локализации капсульных антигенов;
— защита клеток от фагоцитоза, механических повреждений и высыхания;
Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. По количеству и расположению жгутиков выделяют следующие группы бактерий:
— монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;
— амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
— лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;
— перитрихи – бактерии со множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином.
Ворсинки (пили). Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (пили общего типа) или в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим белком пилином.
У некоторых бактерий образуются эндоспоры, которые способствуют выживанию клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях. Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.
Расположение спор в клетке:
— центральное (возбудитель сибирской язвы);
— терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).
3. Принципы методов выявления капсул, жгутиков, спор
Капсула бактерий не воспринимает красителей. Для выявления капсулы применяют методы, позволяющие окрасить фон препарата и тело бактериальной клетки. Выявление капсулы по методу Бурри-Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно осторожно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на черно-коричневом фоне препарата.
Для выявления жгутиков готовят мазок и окрашивают его по Леффлеру:
1. Взвесь бактерий наносят в виде капли на предметное стекло и высушивают, не распределяя каплю по стеклу.
2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (смесь раствора фуксина с танином и сернокислым железом).
3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.
4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.
5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.
Споры бактерий с трудом воспринимают красители, поэтому применяют методы, позволяющие “разрыхлить” споровые оболочки и проникнуть красителю в глубокие слои. Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Литература для подготовки к занятию:
1. Борисов микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.
3 Поздеев микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.