Пребиотики и синобиотики: применение и состав + полезная таблица
В прошлой публикации мы собрали воедино научно-обоснованные факты о пробиотиках и дали таблицу с составом ЛС и БАД. В этой статье разбираемся с местом пре- и синбиотиков в современной медицине
Пребиотики – этот термин используется для обозначения как пребиотиков (содержащих вещества, способствующие росту микроорганизмов), так и метабиотиков (содержащих метаболиты, продукты жизнедеятельности микрорганизмов). Самые распространённые из пребиотических компонентов: олигофруктоза, инулин, галакто-олигосахариды, лактулоза, олигосахариды грудного молока, бутират, молочная кислота и др.
Механизмы действия пребиотиков связаны с взаимодействием между микробиотой и макроорганизмом и разделяются на:
К пребиотикам предъявляются достаточно строгие требования:
Галоктоолигосахариды, олигофруктоза, фруктоолигосахариды (глюкоза, фруктоза, декстроза, мальтоза, мальтотриоза, мальтодекстрин – представлены в составе синбиотиков), лактулоза ( Дюфалак, Нормазе, Портлак, Прелакс и т.д. )
Водный субстрат продуктов обмена веществ Escherichia coli DSM 4087, Enterococcus faecalis DSM 4086, Lactobacillus acidophilus DSM 4149 и Lactobacillus helveticus DSM 4183 ( Хилак Форте )
Кальция бутират + инулин ( Закофальк )
Метаболиты бесклеточной культуральной жидкости бактерий B.subtilis штамм 3 + цеолит + ферментированный гидролизат соевой муки ( Бактистатин )
Секреторные ферменты от 16 штаммов лактобактерий, полученные путем брожения в течение 1 года на сое+лимонная кислота+молочная кислота ( Дайго )
Область применения пребиотиков: коррекция и профилактика дисбиотических состояний. [3,4]. При печеночной энцефалопатии и при функциональном запоре в качестве монотерапии рекомендована лактулоза с высоким уровнем доказательности (A-B, об уровнях доказательности читайте здесь ) [1]. В международных рекомендациях для профилактики (или профилактика рецидива) антибиотик-ассоциированной диареи (в т.ч. вызванной Clostridium difficile ) рекомендованы в комплексной терапии – олигофруктоза 4 г, три раза в день со средним уровнем доказательности [2]. При синдроме раздраженного кишечника назначение пребиотиков влияет на качество жизни (за счёт нормализации стула, уменьшения числа обострений и интенсивности абдоминального болевого синдрома),– короткоцепочечные фруктоолигосахариды 5 г/ежедневно или галакто-олигосахариды 3.5 г/ежедневно – с уровнем доказательности B-C [1].
Отметим, что в РФ фрукто- и олигосахариды представлены в только в виде комбинированных препаратов, а в рекомендуемых количествах только в составе некоторых синбиотиков, н апример, в БАД Энтеролактис, Максилак, РиоФлора. Во многих средствпх количественный состав не уточнен.
Синбиотики
Lactobacillus acidophilus CBT LA1 + Lactobacillus rhamnosus CBT LR5 + Bifidobacterium longum CBT BG7 + Bifidobacterium lactis CBT BL3 + Bifidobacterium bifidum CBT BF3 +Streptococcus thermophilus CBT ST3 + фруктоолигосахариды ( Необиотик Лактобаланс )
Lactobacillus acidophilus CBT LA14 + Lactobacillus rhamnosus CBT LR32 + Bifidobacterium lactis CBT BL4 + инулин + витамины группы В-В1,В6,В12 ( Флориоза )
Lactobacillus rhamnosus + Bifidobacterium bifidum + Lactobacillus acidophilus + Lactobacillus plantarum + Lactobacillus bulgaricus +инулин+псилиум ( Фитомуцил Сорбент форте )
Lactobacillus Acidofilus LA-5 и Bifidobacterium ВВ-12 + фруктоолигосахариды + нутриоза + гидроксипропилметилцеллюлоза ( Флорок форте )
Bifidobacterium animalis subspecies lactis BS01 + инулин, мальтодекстрин ( Пробиолог транзит [H7] )
Bifidobacterium bifidum + Bifidobacterium longum + Bifidobacterium infantis + Lactobacillus rhamnosus+ микрокристаллическая целлюлоза + олигофруктоза ( Флоросан )
L.rhamnosus R049 + L.caseiR215 + L.plantarum R202 + L.acidophilus R053 + B.longum R023 + B.bifidum R071 + B.breve R070 + фруктоолигосахариды ( Флора-Дофилус )
Bifidobacterium bifidum W23 + Bifidobacterium lactis W51 + Lactobacillus acidophilus W37 + Lactobacillus acidophilus W55 + Lactobacillus paracasei W20 + Lactobacillus plantarum W62 + Lactobacillus rhamnosus W71 + Lactobacillus salivarius W24 + инулин + фруктоолигосахариды 1,2% ( РиоФлора )
Bifidobacterium longum + Bifidobacterium breve + Lactobacillus acidophilus + Lactobacillus rhamnosus + Lactobacillus plantarum + Lactobacillus casei + Lactococcus lactis + Streptococcus thermophilus + Фруктоолигосахариды 5 г + микрокристаллическая целлюлоза ( Максилак )
Lactobacillus acidophilus DDS®-1, B.bifidum UABB-10, B.longum UABL-14, B.lactis UABLA-12, рисовый мальтодекстрин, фруктоологосахариды ( ЛББ )
Синбиотики, отличаются от пробиотиков наличием пребиотических компонентов, а также более сбалансированным составом c большим количеством штаммов микроорганизмов в составе препаратов. Обычно комбинацию составляют несколько штаммов бифдо- и лактобактерий. Также синбиотики, зарегистрированные в последние несколько лет, уже имеют в составе пробиотические компоненты в рекомендуемых дозах – около 5 г фрукто-олигосахаридов.
В настоящий момент со средним и низким уровнем доказательности (B-C), ввиду недостаточного количества исследований, рекомендованы следующие комбинации:
Увеличение количества компонентов не сделало синбиотики универсальными препаратами. При разных состояниях показали свою эффективность разные комбинации микроорганизмов.
Подводим итог по всем биотикам
На данный момент все рекомендации по биотикам имеют слабую силу. Для некоторых нозоологий (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, диарея, псевдомембранозный колит) назначение пробиотиков, особенно комбинаций, не рекомендуется из-за недостаточной степени изученности [1,5]. Так же есть вероятность развития сепсиса, вызванного штаммами пробиотических микроорганизмов, у групп риска – наличие иммунного дефицита, ослабленные пациенты, в т.ч. с онкологическими заболеваниями, нарушением кишечного эпителиального барьера. [6]
В настоящий момент основное место применения для про-, пре или синбиотика это профилактика дисбиотических состояний и лечение дисбиоза при конкретной патологии в составе комплексной терапии. В клинической практике продолжают использоваться пробиотики всех поколений. Эффект от пребиотика проявится быстрее, но пробиотик будет работать дольше. Выбор препарата будет обусловлен не только клиническими рекомендациями, безопасностью препарата, но также конкретной клинической ситуацией: при наличии синдрома диареи – препаратом выбора может быть пробиотик 4го поколения или синбиотик, при наличии синдрома избыточного бактериального роста – санирующие пробиотики 2-го поколения, а при запоре – лучше показали себя некоторые пребиотики. Но то, как будет работать про- или пребиотик в каждой конкретной ситуации зависит не только от самого препарата, но и от индивидуальных особенностей микробиоты человека.
Применение пробиотических и пребиотических и синбиотических препаратов продолжает оставаться перспективным для дальнейших клинических исследований. Пробиотические препараты широко используются в медицинской реабилитации и комплексе профилактических мероприятий [2]. Дальнейшие исследования будут способствовать усилению требований к данным препаратам с точки зрения безопасности и доказанной эффективности. Несмотря на большое разнообразие различных штаммов микроорганизмов и их комбинаций, остается нерешенной проблемой индивидуального подбора препаратов. Это связано с тем, что кишечный микробиом у каждого человека индивидуален, а современные методы для оценки состава кишечной микробиоты не применяются широко.
Ароматообразующая закваска LH-B02
Возвращаем 10% бонусами
Удобные способы оплаты
Похожие товары
Закваска Hansen LH-B02 содержит штамм Lactobacillus helveticus, используется в производстве сыров итальянского и швейцарского типа, придаёт пряный, выраженный сырный вкус.
Может применяться как отдельно, так и в комбинации с другими молочными культурами, например, Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Закваска является ароматообразующей. Культура, формирующая профиль вкуса сыров, полностью раскрывает аромат сыра во время созревания и образуют развитый рисунок.
Состав: Lactobacillus helveticus
LH-B02 признана кошерной (Circle K D) для круглогодичного использования.
Способ применения и дозировка:
Размер упаковки: 50 U. Упаковка рассчитана на 500 л молока.
Транспортировка: допускается транспортировка до 2-х недель без соблюдения температурного режима.
Производитель: Chr. Hansen, Дания
Скидка 3% предоставляется при онлайн оплате заказа любым удобным способом:
Написать отзыв
Ваш отзыв: Внимание: HTML не поддерживается! Используйте обычный текст.
Максифлор ® максимум (Maxiflor maximum) инструкция по применению
Владелец регистрационного удостоверения:
Произведено:
Контакты для обращений:
Лекарственная форма
Форма выпуска, упаковка и состав продукта Максифлор ® максимум
Капсулы массой 500 мг.
| 1 капс. | |
| пробиотические микроорганизмы | ≥5.5 × 10 10 КОЕ * |
| в т.ч. бифидобактерии | 5 × 10 10 КОЕ |
| Bifidobacterium longum | 6.7 × 10 9 КОЕ |
| Bifidobacterium lactis | 2.5 × 10 10 КОЕ |
| Bifidobacterium breve | 1 × 10 10 КОЕ |
| Bifidobacterium bifidum | 6.7 × 10 9 КОЕ |
| Bifidobacterium infantis | 1.6 × 10 9 КОЕ |
| в т.ч. лактобактерии | 5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus bulgaricus | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus helveticus | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus gasseri | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus acidophilus | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus reuteri | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus salivarius | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus rhamnosus | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus plantarum | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus casei | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| Lactobacillus paracasei | 0.5 × 10 9 КОЕ |
| пребиотический компонент: фруктоолигосахариды | 50 мг |
Вспомогательные вещества: гидроксипропилметилцеллюлоза (оболочка), мальтодекстрин (стабилизатор), титана диоксид (краситель).
Максифлор ® Максимум сочетает в себе пробиотические бактерии и пребиотик, что способствует выживанию полезных микроорганизмов и усилению их благотворного воздействия на работу ЖКТ.
Бифидобактерии составляют основу микрофлоры ЖКТ человека. Обеспечивают процессы обмена белков и жиров и участвуют в регуляции минерального обмена, синтезе аминокислот, витаминов К и группы В. Кроме своих основных функций, эти микроорганизмы:
Заслуга бифидобактерий заключается в нормализации сокращения стенок кишечника, что обеспечивает своевременную и стабильную эвакуацию продуктов пищеварения из организма.
Лактобактерии полезны не меньше, чем бифидобактерии:
Пребиотики (фруктоолигосахариды) служат питательной средой для пробиотических бактерий. Пребиотики не всасываются в верхних отделах ЖКТ и нетронутыми доходят до толстого кишечника, где их утилизируют бактерии. Тем самым пребиотики стимулируют рост и повышение биологической активности нормальной микрофлоры кишечника, улучшают перистальтику и пищеварение.
Технология микрокапсулирования позволяет «упаковывать» полезные бактерии в микрокапсулы, обеспечивая повышенную защиту от негативных факторов. Высвобождение пробиотиков происходит именно в кишечнике, обеспечивая высокую биологическую активность и способствуя нормализации баланса микрофлоры.
При производстве Максифлор ® Максимум использованы капсулы из растительного сырья. Это отличное решение для тех, кто отказался от продуктов животного происхождения. Такая капсула стабильна при широком диапазоне температуры и влажности, надежно сохраняет содержимое. При этом легко проглатывается и быстро растворяется в ЖКТ.
Предназначен для повышения защиты и поддержания баланса кишечной микрофлоры, в т.ч. при хронических проблемах с ЖКТ, ослабленном иммунитете. Способствует ослаблению побочных эффектов при интенсивной антибиотикотерапии и после нее.
Стобионт (Stobiont) инструкция по применению
Владелец регистрационного удостоверения:
Произведено:
Контакты для обращений:
Лекарственная форма
Форма выпуска, упаковка и состав продукта Стобионт
Капсулы массой 480 мг.
| 1 капс. | |
| лактобактерии казеи (Lactobacillus casei) | 580 млн. КОЕ |
| лактобактерии рамнозус (Lactobacillus rhamnosus) | 320 млн. КОЕ |
| лактобактерии плантарум (Lactobacillus plantarum) | 320 млн. КОЕ |
| лактобактерии лактис (Lactobacillus lactis) | 40 млн. КОЕ |
| лактобактерии саливариус (Lactobacillus salivarius) | 20 млн. КОЕ |
| лактобактерии хельветикус (Lactobacillus helveticus) | 20 млн. КОЕ |
| лактобактерии ферментум (Lactobacillus fermentum) | 10 млн. КОЕ |
| бифидобактерии лонгум (Bifidobacterium longum) | 100 млн. КОЕ |
| бифидобактерии бифидум (Bifidobacterium bifidum) | 100 млн. КОЕ |
| бифидобактерии бреве (Bifidobacterium breve) | 100 млн. КОЕ |
| бифидобактерии инфантис (Bifidobacterium infantis) | 20 млн. КОЕ |
| ацидофильные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidоphilus) | 100 млн. КОЕ |
| термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus) | 40 млн. КОЕ |
| колекальциферол (вит. D 3 ) | 5 мкг (200 ME) (100% РНП # ) |
| цинк (в форме цинка цитрата) | 10 мг (83% РНП # ) |
| экстракт бурых водорослей (Fucus vesiculosus/фукус пузырчатый) | 131.25 мг (25% РНП # ) |
| со стандартным содержанием йода | 37.5 мкг |
Состав: объемообразующий агент (целлюлоза микрокристаллическая), оболочка капсулы (гипромеллоза), цинка стеарат, лактобактерии казеи (Lactobacillus casei), антислеживающий агент (магния стеарат), лактобактерии рамнозус (Lactobacillus rhamnosus), лактобактерии плантарум (Lactobacillus plantarum), экстракт бурых водорослей, колекальциферол, бифидобактерии лонгум (Bifidobacterium longum), бифидобактерии бифидум (Bifidobacterium bifidum), бифидобактерии бреве (Bifidobacterium breve), ацидофильные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidiphilus), термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus), лактобактерии лактис (Lactobacillus lactis), лактобактерии саливариус (Lactobacillus salivarius), лактобактерии хельветикус (Lactobacillus helveticus), бифидобактерии инфантис (Bifidobacterium infantis), лактобактерии ферментум (Lactobacillus fermentum).
| Пищевая ценность | 100 г | % РНП # |
| Белки | 0.1 г | 0% |
| Жиры | 0 г | 0% |
| Углеводы | 0.1 г | 0% |
# рекомендуемая норма потребления.
Энергетическая ценность (100 г): 260 кДж/62 ккал.
Комплекс для нормализации работы пищеварительной системы и восстановления микрофлоры кишечника. Способствует повышению иммунной защиты в периоды сезонных всплесков заболеваемости.
Лактобактерии казеи (Lactobacillus casei) способствуют выработке молочной кислоты, которая позволяет снижать кислотность в пищеварительной системе.
Лактобактерии рамнозус (Lactobacillus rhamnosus) подавляют рост патогенной микрофлоры в кишечнике, способствуют нормализации вагинальной микрофлоры и восстановлению естественной кислой среды во влагалище.
Лактобактерии плантарум (Lactobacillus plantarum) способствуют сохранению и усвоению питательных веществ, витаминов и антиоксидантов.
Лактобактерии лактис (Lactobacillus lactis) способствуют снижению кислотности и подавлению роста грибковой и патогенной микрофлоры.
Лактобактерии саливариус (Lactobacillus salivarius) подавляют рост патогенной микрофлоры.
Лактобактерии хельветикус (Lactobacillus helveticus) обладают противоопухолевой активностью и иммуномодулирующими свойствами.
Лактобактерии ферментум (Lactobacillus fermentum) оказывают антибактериальное действие на некоторые микроорганизмы, обладают антиоксидантной активностью.
Бифидобактерии лонгум (Bifidobacterium longum) предупреждают развитие патогенной микрофлоры.
Бифидобактерии бифидум (Bifidobacterium bifidum) обеспечивают баланс микрофлоры кишечника, стимулируют работу иммунной и пищеварительной систем.
Бифидобактерии бреве (Bifidobacterium breve) способствуют устранению проявлений метеоризма, диареи, синдрома раздраженного кишечника.
Бифидобактерии инфантис (Bifidobacterium infantis) способствуют лучшему усвоению витамина D.
Ацидофильные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus) обладают выраженными бактерицидными свойствами, подавляют процессы брожения в толстом кишечнике.
Термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus) способствует лучшему усвоению пищи, повышению защитных сил организма, обладает противовоспалительной активностью.
Цинк способствует предотвращению расстройств ЖКТ, уменьшению воспалительных процессов в кишечнике.
Витамин D 3 обеспечивает усвоение кальция, способствует укреплению костной ткани, повышению иммунитета, улучшению настроения.
Йод при совместном применении с пробиотическими культурами обладает большей биодоступностью.
Lactobacillus helveticus что это такое
Центр клеточных и генных технологий, ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН, 123182 Москва, Россия
Видовое разнообразие лактобактерий вагинального микробиома: как посмотреть
Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018;36(3): 3-12
Демкин В. В. Видовое разнообразие лактобактерий вагинального микробиома: как посмотреть. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2018;36(3):3-12.
Demkin V V. Species diversity of lactobacillus of vaginal microbiom: how to see. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2018;36(3):3-12.
https://doi.org/10.17116/molgen2018360313
Центр клеточных и генных технологий, ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН, 123182 Москва, Россия
В обзоре сделана попытка проследить эволюцию знаний о видовом разнообразии лактобактерий в историческом ракурсе, с момента их открытия и по настоящее время, с учетом технических особенностей экспериментов, которые могут влиять на конечные результаты исследований. Проводится сравнение данных, полученных с использованием различных методов идентификации лактобактерий: после выделения изолятов на основе предварительного культивирования с использованием фенотипических и генотипических методов, на основе прямого определения видов методами высокопроизводительного секвенирования и ПЦР.
Центр клеточных и генных технологий, ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН, 123182 Москва, Россия
Лактобактерии являются одним из основных компонентов влагалищной микрофлоры. Считается, что именно эти бактерии играют ключевую роль в поддержании здоровья и нормального функционирования микробиоценоза женской репродуктивной сферы. Нарушение вагинальной микробной экосистемы обычно сопровождается снижением количества лактобацилл и чрезмерным ростом анаэробов. Отношение к лактобактериям как к маркеру вагинального здоровья сложилось с начала их открытия, но представление об их видовом составе менялось на протяжении всей истории изучения вагинального биоценоза. За прошедшие более чем 100 лет многократно менялась классификация лактобактерий, развивались методы их детекции и дифференциации. Все это создает серьезные трудности при сравнении результатов определения состава вагинального биоценоза и видовой идентичности штаммов в публикациях разных лет. Но даже работы в одном историческом периоде, полученные разными авторами с использованием различных методов идентификации, нередко имеют серьезные расхождения как в части выявляемого разнообразия видов лактобактерий, так и в части определения преобладающих видов.
В обзоре сделана попытка проследить эволюцию знаний о видовом разнообразии лактобактерий в историческом ракурсе с момента их открытия и по настоящее время, с учетом технических особенностей экспериментов, которые могут влиять на конечные результаты исследований.
Классификация лактобактерий
Лактобактерии — грамположительные анаэробные не спорообразующие молочнокислые бактерии. Род Lactobacillus является одним из самых многочисленных по видовому составу родов бактерий и состоит более чем из 200 видов [1]. Классификация лактобактерий имеет сложную и даже запутанную историю. Ранняя классификация лактобактерий строилась на основании типа сбраживания сахаров и набора образующихся метаболитов и делила лактобактерии на облигатные гомоферментативные, факультативные гетероферментативные и облигатные гетероферментативные. Другие фенотипические свойства (например, культуральные характеристики, состав клеточной стенки, биохимические активности, состав жирных кислот) обеспечивали более детальную дифференциацию видов и штаммов. Введение в 90-х годах прошлого столетия генотипических критериев выявило множество противоречий между фенотипической и филогенетической систематикой лактобактерий. В последующие годы смена фенотипической парадигмы классификации бактерий на филогенетическую повлекла за собой серьезный пересмотр всей структуры систематики лактобактерий, смену таксономического статуса некоторых видов, появление новых имен в таксономическом списке. Если в 1991 г. члены рода Lactobacillus формировали 3 группы [2], то в 1995 г. с использованием фенотипических и генетических критериев было предложено 5 групп [3], в 2003 г. — 7 филогенетических групп [4], а в 2007 г. — 12 групп [5]. Современная классификация, в основе которой лежат генотипические критерии, делит род Lactobacillus на 18 филогенетических групп, самыми крупными (более 10 видов) из которых являются группа L. delbrueckii, группа L. salivarius, группа L. reuteri, группа L. buchneri [1].
Большинство видов, обнаруживаемых в вагинальном микробиоценозе, включая L. crispatus, L. gasseri, L. iners, L. jensenii, L. johnsonii (см. далее), относятся к группе L. delbrueckii. Вид L. delbrueckii является старейшим и типовым видом рода Lactobacillus, и в свою очередь делится на 5 подвидов. Кроме того, группа содержит вид L. acidophilus — один из наиболее известных видов лактобактерий, и долгое время считавшийся основным и единственным видом здоровой вагинальной биоты. Несколько видов, филогенетически близких L. acidophilus (L. amylophilus, L. crispatus, L. galinarum, L. gasseri, L. johnsonii), иногда объединяют в группу L. acidophilus, но эта группа не имеет официального статуса. Помимо L. delbrueckii и L. acidophilus, группа L. delbrueckii насчитывает еще по крайней мере 26 видов (список постоянно пополняется), выделенных из разнообразных источников, включая человека, животных и растения. Некоторые виды внутри группы не могут быть дифференцированы по фенотипическим признакам, и их видовая принадлежность определяется исключительно генотипическими критериями. Некоторые из видов по генотипическим критериям делятся на подвиды.
Регулярные изменения в классификации лактобактерий за счет пополнения новыми видами и в результате реклассификации отдельных видов создают проблемы при сравнении видовой идентичности штаммов в публикациях разных лет.
Изучение вагинальных лактобактерий с использованием фенотипической идентификации
Идентификация бактерий до начала 80-х годов прошлого века строилась исключительно на фенотипических показателях (морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и антигенные свойства), предварительно выращенных на искусственных средах бактерий. Фенотипические характеристики подвержены вариациям под действием различных факторов, включая условия культивирования, что часто приводит к неопределенным результатам при практической идентификации штаммов. Этим, отчасти, можно объяснить достаточно противоречивые в публикациях разных авторов данные о видовом разнообразии вагинальных лактобактерий (см. табл. 1). Кроме того, разные бактерии требуют различных ростовых факторов и условий культивирования, поэтому высев на специализированные среды создает своеобразный фильтр, который может существенно изменить показатели соотношения различных видов бактериального сообщества или даже исключить некоторые из них при высеве сложных образцов. Яркой иллюстрацией тому служит история открытия одного из ключевых, как мы теперь знаем, видов вагинальной экосистемы — L. iners. Оказалось, что бактерии L. iners не растут на твердых средах MRS и Rogosa, повсеместно используемых для культивирования лактобактерий с середины прошлого века и по сей день. Очевидно, что эта особенность предопределила позднее открытие L. iners лишь в 1999 г. [16].
На рубеже 70—80-х годов прошлого столетия в микробиологию стали активно внедряться методы генотипирования, а классификация бактерий стала строиться на филогенетических принципах. С одной стороны, это увеличило возможности для дифференциации видов, но, с другой стороны, повлекло за собой серьезные изменения в таксономии лактобактерий. В это время произошло несколько событий, которые повлияли на описание видового разнообразия вагинальных лактобактерий. Выяснилось, что лактобактерии, приписываемые к виду L. acidophilus, генетически гетерогенны и формируют 6 кластеров, которые впоследствии были классифицированы как самостоятельные виды: L. acidophilus sensu stricto, L. amylovorus, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri и L. johnsonii [17—19]. На основе генотипических критериев, ранее выявляемые в вагинальной микробиоте виды L. lactis и L. leichmannii были реклассифицированы в L. delbrueckii subsp. lactis [20], L. casei var. rhamnosus реклассифицирован в L. rhamnosus [21], а L. minutus сменил родовую принадлежность на Atopobium [22]. В это же время был декларирован новый вид L. vaginalis, который сформировали штаммы, имевшие близкие свойства с L. fermentum [23].
Несмотря на «наступление» генотипических методов, традиционные фенотипические методы идентификации продолжали еще использоваться при изучении состава вагинальной микробиоты и после 1990-х годов [9, 24, 25]. Для этих работ характерен относительно высокий процент выявления (23—40%) такого вида, как L. acidophilus, но спектр других доминирующих видов стал меняться: достаточно часто в качестве доминирующих видов стали фигурировать L. jensenii, L. casei, L. fermentum, реже встречались L. brevis, L. crispatus, L. gasseri (см. табл. 1). Обращает на себя внимание относительно низкая выявляемость такого вида, как L. crispatus, который, как мы увидим ниже, при использовании генетических критериев определялся в вагинальных микробиотах здоровых женщин в высокой пропорции.
Следует, однако, подчеркнуть, что данные, полученные разными авторами с использованием фенотипических методов идентификации, имели серьезные расхождения между собой как в части выявляемого разнообразия видов лактобактерий, так и в части определения преобладающих видов.
Масс-спектрометрия MALDI TOF
В последнее десятилетие приобретает популярность идентификация бактерий методом масс-спектрометрии MALDI TOF [26]. Этот метод анализирует белковый спектр бактериальной клетки, т. е. характеризует фенотипические свойства бактерий. С использованием этого метода в качестве основных видов вагинальных лактобактерий были заявлены L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri, а минорными компонентами в разных исследованиях фигурировали виды из списка L. acidophilus, L. casei, L. delbrueckii, L. fermentum, L. harbinensis, L. mucosae, L. oris, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, L. ultunensis, L. zeae [27—31]. Если при предварительном культивировании использовали среды, на которых могли расти и L. iners, то выявляли и этот вид [27].
Дифференциация лактобактерий методами генотипирования
В конце 1970-х годов Карл Возе предложил использовать гены рибосомных РНК в качестве молекулярных маркеров для классификации бактерий [32]. Новый принцип в сочетании с бурным развитием молекулярно-генетических методов идентификации микроорганизмов привел к заметному изменению представлений о биоразнообразии бактериального мира в целом, что не могло не отразиться и на представлении о видовом своеобразии вагинальных лактобактерий. Различные методы генотипирования были предложены в качестве инструментов как для идентификации видов, так и для дифференциации штаммов лактобактерий до их клонального уровня [33]. Основные преимущества методов на основе генотипического анализа заключаются в высокой дискриминационной способности и в их универсальной применимости. Использование генотипических подходов привело к изменению представления о видовом составе вагинальных микробиот, в частности о доминирующих видах лактобактерий. Как уже упоминалось, анализ гомологии ДНК привел к разделению вида L. acidophilus на 6 самостоятельных видов. В последовавших после этого исследованиях с использованием методов ДНК-ДНК-гибридизации среди самых распространенных видов стали распознавать L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii, еще недавно описываемых как L. acidophilus [34, 35]. В этих же работах с низкой частотой выявляли: L. fermentum, L. oris, L. plantarum, L. reuteri, L. ruminis, L. salivarius, L. vaginalis. Доминирующую роль играли бактерии из группы L. acidophilus, тогда как собственно L. acidophilus перестал упоминаться даже среди редко встречающихся видов. Впервые в качестве вагинальных видов упоминаются L. oris, L. reuteri, L. ruminis, L. vaginalis (см. табл. 1).
Мы не рассматриваем здесь большое количество работ, в которых анализ лактобактерий проводили c применением таких методов, как денатурирующий градиентный гель-электрофорез (denaturing gradient gel electrophoresis — DGGE), температурный градиентный гель-электрофорез (temperature gradient gel electrophoresis — TTGE), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism analysis — RFLP), анализ полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов (terminal restriction fragment length polymorphism analysis, tRFLP, T-RFLP), ПЦР-генотипирование со случайными праймерами (randomly amplified polymorphic DNA) и др., так как эти методы, обладая хорошими дискриминирующими возможностями, имеют недостаточную специфичность при идентификации видов.
В XXI веке для видовой идентификации выращенных на искусственных средах лактобактерий стали активно использовать секвенирование. Секвенирование следует признать самым надежным методом таксономической идентификации бактерий хотя бы потому, что последовательность гена 16S рРНК положена в основу современной классификации бактерий. В первых работах, до наступления эры высокопроизводительного секвенирования (ВПС), использовали традиционный на тот момент метод последовательного секвенирования по Сэнгеру [36].
Секвенирование, как метод идентификации лактобактерий, утвердил на первых позициях в вагинальной микробиоте здоровых женщин виды L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii [37—44] (см. табл. 1). Обозначилось и место недавно открытого вида L. iners, который находили в относительно высокой пропорции в вагинальных мазках от женщин с бактериальным вагинозом с той лишь оговоркой, что эффективность выявления этого вида зависела от среды, которую использовали для выделения изолятов перед их идентификацией [39, 42]. Регулярно, но в низкой пропорции определяли L. vaginalis [38—41, 43]. Помимо указанных видов, некоторые исследователи в единичных случаях или в низкой пропорции идентифицировали L. coleohominis [41—43], L. fermentum [38, 44], L. mucosae, L. paracasei, [38, 43], L. rhamnosus [38, 43—45]. Такие виды, как L. brevis, L. casei, L. delbrueckii, L. fornicalis, L. kefiranofaciens, L. minutus, L. pontis, L. ruminis, L. salivarius, упоминались в публикациях только одной из исследовательских групп и не выявлялись другими исследователями [40—44]. Стоит подчеркнуть, что данные о «минорных» лактобактериях, полученные различными исследовательскими группами, плохо коррелировали между собой, а их выявление наиболее часто было связано с образцами, взятыми от женщин с бактериальным вагинозом.
Высокопроизводительное секвенирование
Широкое наступление методов молекулярно-генетического анализа бактериальных сообществ долгое время не меняло общего подхода к самому анализу: предварительное культивирование бактерий на специальных средах с последующим анализом выделенных изолятов. С развитием молекулярно-генетических методов исследования и утверждением филогенетической таксономии были предложены новые методические подходы, способные установить видовой состав сложных микробных сообществ без предварительного выделения и культивирования бактериальных клонов. Появление в последнее десятилетие новых технологий секвенирования, получивших различные наименования: высокопроизводительное (ВПС) или высокоэффективное секвенирование (high-throughput), секвенирование следующего поколения (next-generation sequencing — NGS), массивное параллельное секвенирование (massively parallel sequencing), значительно расширило возможности такого анализа. При некоторых различиях в технических принципах реализации технологий методы нового поколения выделяются способностью обеспечивать параллельное секвенирование большого количества молекул из одного или нескольких образцов. Последующая биоинформатическая обработка данных позволяет не только идентифицировать видовую принадлежность полученных сиквенсов, но и получить информацию о видовом разнообразии всех присутствующих в образце бактерий и их пропорции. ВПС позволяет преодолеть трудности с выявлением некультивируемых и «прихотливых» организмов, имеющие место при использовании методов на основе предварительного культивирования бактерий. ВПС также значительно менее трудоемкая процедура, чем методы, связанные с клонированием. Отмеченные преимущества позволяют существенно увеличить размеры выборок исследуемых образцов.
При всей кажущейся мощи технологий ВПС они обладают и рядом ограничений, которые зависят от технологической платформы. Существует несколько технологических платформ ВПС [46, 47], но две из них преобладают, по крайней мере, при изучении вагинальных микробиот (табл. 2). Таблица 2. Лактобактерии, выявленные в вагинальных образцах по результатам ВПС Одна платформа, реализованная в секвенаторе Roche 454 и цитируемая в литературе как 454 или «пиросеквенирование», может производить до 1 млн прочтений (ридов) высокого качества длиной до 400—800 нуклеотидов, в зависимости от модели секвенатора. Другая платформа, изначально цитируемая в литературе как Солекса (SOLEXA), по имени компании — разработчика технологии, а затем получившая название Иллюмина (Illumina), по имени компании, приобретшей эту технологию и выпускающую на ее платформе коммерческие секвенаторы, может производить до 3 млрд прочтений высокого качества, с длиной чтения до 100—250 оснований в зависимости от модели секвенатора. Часть секвенируемой последовательности занимают технические участки, которые создаются на этапе подготовки библиотеки фрагментов, что снижает эффективный размер секвенирования.
Важнейшим фактором результативности технологий секвенирования на платформах 454 и Иллюмина является выбор амплифицируемого участка, а также алгоритмов биоинформатического анализа полученных ридов. При анализе видового разнообразия бактерий наиболее частой мишенью является ген 16S рРНК. Во-первых, этот ген является обязательной частью любых бактериальных геномов. Во-вторых, как уже указывалось выше, последовательность и полиморфизм гена 16S рРНК лежат в основе современной таксономии бактерий. Ген 16S рРНК имеет структуру из чередующихся консервативных и гипервариабельных (V1—V9) участков. Консервативные участки гена используют в качестве сайтов посадки праймеров, фланкирующих заключенные между ними вариабельные области. Такая конфигурация мишени позволяет проводить амплификацию участков гена 16S рРНК у широкого круга бактерий, тогда как внутренние участки обеспечивают их таксономическую идентификацию.
Из-за ограничений по длине секвенирования при ВПС для создания библиотеки секвенируемых фрагментов проводят амплификацию относительно коротких фрагментов мишени, которые могут включать в себя от 1 до 3 гипервариабельных участков, что сказывается на точности таксономической дискриминации и классификации ампликонов. Это особенно актуально для платформы Иллюмина, чьи пределы секвенирования ограничены размерами 100—250 оснований. Более длинные прочтения, позволяющие включить в анализ 2—3 гипервариабельные области, предоставляет больше информации для дискриминации последовательностей до более низких таксономических уровней.
Еще одна причина, способная повлиять на интерпретацию результатов ВПС, связана с использованием различных программных алгоритмов обработки ридов и верифицированных баз референсных последовательностей. Множество охарактеризованных последовательностей 16S рРНК является незавершенным, но постоянно пополняется, что улучшает дискриминирующие возможности более поздних работ по сравнению с их предшественниками. Базы для других генов-мишеней значительно меньше и пополняются более медленными темпами, хотя обладают и большими дискриминирующими возможностями по сравнению с базой последовательностей 16S рРНК за счет более выраженной вариабельности белоккодирующих генов.
Степень, с которой технические особенности эксперимента могут влиять на конечные результаты, показывает работа, в которой секвенирование одних и тех же образцов проводили с использованием двух платформ секвенирования (Roche 454 и Иллюмина) и различных алгоритмов биоинформатической обработки данных [48]. Смена платформ секвенирования приводила к реклассификации от 7 до 41% ридов, тогда как использование различных алгоритмов оценки результатов приводило к реклассификации до 32% ридов. Интересно, что проблемы таксономической идентификации в наибольшей степени затронули такие таксоны, как Lactobacillus и Gardnerella [48], которые представляют собой основных участников вагинального биоценоза.
Еще один важный показатель для оценки результатов секвенирования — глубина секвенирования, или множественность прочтений, который показывает количество прочтений одной и той же последовательности. Большая глубина секвенирования позволяет более надежно отфильтровать экспериментальный «шум» и добиться более точной идентификации ридов, что отражается, в первую очередь, на достоверности выявления минорных последовательностей.
Различия в результатах анализа вагинальной микробиоты методами ВПС с учетом некоторых технических особенностей секвенирования показаны в табл. 2. Данные, полученные на платформе Иллюмина, дают более бедные, с точки зрения видового разноообразия, результаты. ВПС на платформе пиросеквенирования дает большее разнообразие видов лактобактерий. Помимо видов L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri, наличие которых установлено различными независимыми группами исследователей, упоминаются и такие виды, как L. acidophilus, L. coleohominis, L. fermentum, L. fornicalis, L. helveticus, L. johnsonii, L. psittaci, L reuteri, L. rhamnosus, L. vaginalis, которые выявляются в значительно более низких или даже в следовых количествах [49—62] (см. табл. 2).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Метод ПЦР стал «золотым стандартом» для детекции и идентификации бактерий и вирусов. Определению тех или иных видов лактобактерий в вагинальных микробиотах методами ПЦР было посвящено много исследований. В отличие от ВПС, которое позволяет выявлять все возможные виды бактерий, присутствующие в анализируемом образце, ПЦР выявляет только тот спектр бактерий, который определяется специфичностью используемых тест-систем. В контексте настоящего обзора результаты, полученные методом ПЦР, носят подтверждающий характер, и потому детально здесь рассматриваться не будут. В целом данные ПЦР подтверждают ведущее значение видов L. crispatus, L. iners, L. jensenii и L. gasseri в вагинальных микробиотах с доминированием лактобактерий [63—66], а также возможное присутствие таких видов, как L. vaginalis [65, 67], L. fermentum, L. casei subsp. rhamnosus [68, 69], L. acidophilus, L. brevis, L. plantarum, L. johnsonii, L. salivarius, L. reuteri, L. paracasei [69]. Тем не менее метод ПЦР вносит свою лепту в набор противоречивых данных о распространении тех или иных видов лактобактерий, что может быть связано со специфичностью применяемых праймеров. Например, продемонстрированный в отдельных работах высокий процент выявления L. vaginalis [65, 67], L. acidophilus или L. brevis [69] плохо коррелирует с данными других авторов.
Биоразнообразие вагинальных микробиот
Разнообразие вагинальных биоценозов описывается не только видовым разнообразием входящих в них бактериальных видов, но и количественным преобладанием одних видов над другими в пределах одной микробиоты. Количественные оценки относительного преобладания, полученные методами ВПС или количественной ПЦР, показали, что у женщин без медицинских проблем в урогенитальной области в большинстве случаев доминирующим видом в вагинальной микробиоте является L. crispatus, в более редких случаях L. gasseri, или L. jensenii [49—53, 59, 66, 67, 70, 71]. Возможны ситуации, когда 2 или 3 вида лактобактерий могут присутствовать в близких соотношениях. Выявление у здоровых женщин в высокой пропорции других видов лактобактерий должно вызывать в первую очередь вопросы к методической части исследования, хотя и не исключать вклада специфических популяционных, медицинских, социальных или поведенческих факторов. При дисбиотических состояниях, например, как бактериальный вагиноз, картина существенно усложняется. На фоне снижения общего содержания лактобактерий, которое может достигать их полной элиминации, наблюдается заметное увеличение доли анаэробных бактерий из родов Anaerococcus, Atopobium, Corynebacterium, Dialister, Gardnerella, Megasphaera, Mobiluncus, Peptoniphilus, Prevotella, Sneathia и др. [72, 73]. При наличии достаточного уровня лактобактерий в этом случае наиболее часто выявляется L. iners. Также могут выявляться L. gasseri, L. jensenii, L. vaginalis или другие виды лактобактерий. Как правило, при дисбиотических состояниях вагинальной микробиоты видовое разнообразие одновременно выявляемых лактобактерий расширяется.
Описанная картина характерна для женщин из различных регионов планеты, различных рас и возрастов, по крайней мере в пределах детородного периода. В нескольких работах были представлены данные, выпадающие из общепланетарной закономерности: высокий процент выявления L. reuteri и L. salivarius в Индии [74], L. fermentum в Индии и Мексике [44, 74], L. rhamnosus в Мексике и Иране [44, 45]. Насколько эти показатели являются специфичными для указанных регионов, а не следствием методических погрешностей экспериментов, должны показать дополнительные исследования. По крайней мере для Мексики имеются альтернативные данные о преобладающих видах вагинальных лактобактерий [75].
Одной из причин появления противоречивых данных о распространении минорных видов лактобактерий может быть генетическая близость между некоторыми видами, что может приводить к ошибочной идентификации штаммов или сиквенсов. В частности, очень высокий уровень гомологии как по 16S рРНК, так и по геному в целом, имеют L. fornicalis и L. jensenii, L. gasseri и L. johnsonii [1, 38].
Наличие многообразия бактериальных спектров привело к попыткам кластеризации вагинальных микробиот по видовому составу. В большинстве исследований авторы выделяют от 4 до 12 кластеров, что может быть связано не только с особенностями выборок исследуемых образцов, но и с использованием различных методических подходов [41, 49, 51, 53—55, 60, 62, 76, 77]. Наиболее часто группирование микробиот связано с преобладающим видом лактобактерий. Наибольшую популярность получила классификация, в которой вагинальные микробиоты делятся на 5 групп, 4 из которых определены по доминированию одного из основных видов лактобактерий (L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri), а в 5-й группе преобладающими являются анаэробные бактерии, принадлежащие широкому кругу различных родов, тогда как лактобактерии либо не определяются совсем, либо их содержание значительно снижено [49].
Заключение
По мере эволюции методов идентификации бактерий менялись и данные, описывающие биоразнообразие вагинальных лактобактерий. С установлением филогенетического принципа в таксономии и привлечением генотипических методов для идентификации бактерий, в особенности секвенирования, кардинально изменилось представление о бактериальном пейзаже вагинального биоценоза. Вагинальные микробиоты предстали сложными микробными сообществами с сотнями различных видов, в которых лактобактерии стремятся занять доминирующие позиции. Наиболее часто вагинальные лактобактерии представлены видами L. crispatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii, тогда как прародитель трех видов из этой группы — L. acidophilus исчез из числа определяемых видов в большинстве работ, посвященных анализу состава вагинальных микробиот. Выявление минорных видов лактобактерий плохо поддается воспроизведению у разных авторов. Такие противоречия нельзя объяснить только региональными различиями или клиническими особенностями обследованных женщин. Свою лепту в эти противоречия вносят методические особенности идентификации лактобактерий. Различные виды лактобактерий могут вносить различный вклад в жизнедеятельность вагинальной микробиоты, однако конкретная роль каждого вида в настоящее время еще не установлена. Важнейшими индикаторами вагинального здоровья, как сейчас представляется, являются бактерии вида L. crispatus, доминирование которых свидетельствует о нормоценозе, и L. iners, чье преобладающее присутствие сигнализирует о неблагополучии в вагинальном биоценозе. Значение видов L. jensenii и L. gasseri, как и роль других видов лактобактерий, присутствующих в количественном отношении в несоизмеримо более низком соотношении, остаются неясными и представляют интерес для будущих исследований.
Исследование не имело спонсорской поддержки.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции: Демкин Владимир Витальевич, к.м.н., руководитель Центра клеточных и генных технологий, ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН, пл. Академика Курчатова, 2, Москва, Россия; 123182, e-mail: vdemkin@img.ras.ru;
1 Видовые названия лактобактерий здесь и далее приводятся в том виде, в каком они даны в оригинальных публикациях, и могут не соответствовать современной таксономии лактобактерий.
