Оценка Т-клеточного ответа на вирус SARS-CoV-2 методом ELISPOT
Т-клетки начинают вырабатываться организмом раньше, чем антитела. Именно так называемая Т-клетка хэлпер подает сигнал организму для выработки антител. Т-клетка памяти отвечает за длительную защиту от инфекции. Т-клетка киллер атакует клетки, пораженные вирусом, и уничтожает их.
Определение Т-клеточного иммунитета может использоваться как дополнительный маркер комплексной оценки иммунной защиты организма.
Для чего проводится исследование Т-клеточного ответа?
Коронавирус SARS-CoV-2 имеет огромное разнообразие клинических проявлений: от абсолютно бессимптомных форм до развернутой клинической картины с масштабным поражением внутренних органов вплоть до летального исхода. Степень иммунной защиты организма может быть определяющим фактором в понимании особенностей течения заболевания у того или иного человека.
Для того, чтобы полноценно оценить иммунную защиту, необходимо провести комплексное исследование гуморального иммунитета (AgG, AgM) и Т-клеточного иммунитета.
Проведение исследования Т-клеточного иммунитета рекомендовано:
Методика тестирования: технология ELISPOT
Технология ELISPOT – это уникальная методика, зарекомендовавшая себя для определения силы иммунного ответа на инфекцию. Метод показал высокую эффективность при диагностике скрытого туберкулеза, впервые в мире его широко применила английская компания Oxford Immunoteс. В настоящее время технология ELISPOT применяется исследователями по всему миру при разработке вакцин от SARS-CoV-2. Именно эта платформа оценивается как наиболее перспективная из методов оценки Т-клеточного иммунитета.
Где пройти оценку Т-клеточного иммунитета от SARS—CoV-2 в Москве?
Вы можете сдать кровь на исследование в ИДВНЭ имени Святителя Луки (ул. Академика Анохина, д.9). Предварительная запись не требуется, часы работы процедурного кабинета с 8.00 до 14.00. Предварительная подготовка: натощак (не менее 8 часов голода, пить можно только простую воду), не курить за 2 часа до забора крови.
Elispot метод что позволяет определить
Исследование Т-клеточного ответа на вирус SARS-CoV-2 методом ELISPOT
Стоимость исследования
Для физических лиц — 10 800 руб.
Для юридических лиц — 7 400 руб.
Материал для исследования
Венозная кровь человека.
Аннотация
Данное исследование предназначено для оценки Т-клеточного иммунитета у людей, перенесших инфекцию COVID-19 (в том числе бессимптомно) или вакцинированных против вируса SARS-CoV-2.
Исследование позволяет оценить стойкость иммунного ответа на SARS-CoV-2, особенно в тех случаях, когда антитела к вирусу отсутствуют.
Данный тест позволяет определить специфические Т-лимфоциты, способные узнавать вирус SARS-CoV-2, и запускать механизм уничтожения пораженных вирусом клеток.
После проведения исследования вы получите один из трёх вариантов заключения:
С примером заключения можно ознакомиться по этой ссылке.
Результаты оказанной услуги (заключение) не являются основанием для установления диагноза, назначения или коррекции лечения, проведения или отмены профилактических медицинских мероприятий (в том числе вакцинации). Наличие Т-клеточного иммунитета (Т-клеток, специфически отвечающих на определенные антигены вируса SARS-CoV-2) не гарантирует защиту от заболевания/повторного заболевания SARS-CoV-2.
Побочные эффекты
Побочные эффекты отсутствуют.
Противопоказания
Противопоказаний к применению нет.
Описание
SARS-CoV-2 был обнаружен в 2019 году в Ухане, Китай. На данный момент, пандемия COVID-19 продолжается, демонстрируя волнообразный характер течения. Вместе с тем продолжается поиск эффективной вакцины, который возможен только при достоверной оценке иммунного ответа. Существует значительный интерес к тому, насколько адаптивные иммунные реакции контролируют острую инфекцию и обеспечивают защиту от повторного заражения. Механизмы адаптивного (приобретенного) иммунного ответа на вирус SARS-CoV-2 подразделяются на гуморальный иммунный ответ (определяется присутствием антител IgM и IgG) и клеточный иммунный ответ (осуществляется клетками иммунной системы без участия антител). Клеточное звено иммунной системы — прежде всего Т-лимфоциты — играет немаловажную роль в уничтожении SARS-CoV-2 и защите от повторного заражения.
Что такое Т- клеточный иммунитет?
Т-клетки (или Т-лимфоциты) отвечают за иммунитет на клеточном уровне. Т-хелперы участвуют в запуске иммунного ответа и активируют В-клетки (или В-лимфоциты), которые вырабатывают антитела. Т-киллеры, встречаясь с патогеном или инфицированной клеткой, убивают их. По литературным данным, Т-клеточный ответ на SARS-CoV-2 сохраняется в течение 10 месяцев у переболевших COVID-19 пациентов (https://doi.org/10.1038/s41467-021-24377-1).
У части людей, в силу особенностей иммунитета, а также при инфицировании низкой дозой возбудителя Т-клеточный иммунитет уничтожает вирус без вовлечения В-клеточного звена, то есть без образования антител. Это может происходить при отсутствии клинических симптомов. Иными словами, человек может перенести инфекционный процесс без развития болезни, уровень антител у него не определяется, но организм приобретает защиту от повторного заражения. Также есть данные о том, что при наличии Т-клеточного иммунитета против коронавируса COVID-19 заболевание протекает менее тяжело.
Как оценить Т-клеточный иммунитет?
Оценить Т-клеточный иммунитет возможно методом ELISPOT. Если Т-лимфоциты человека уже имели контакт с антигеном, они активируются и начинают вырабатывать гамма-интерферон. После выполнения всех этапов исследования методом ELISPOT на реакционной мембране образуются точки только от тех Т-лимфоцитов, которые «узнали» вирус. Количество точек подсчитывается с помощью считывающего оборудования и сравнивается с пороговым значением.
Кому рекомендуется исследовать Т-клеточный ответ на вирус SARS-CoV-2?
1. Лицам после вакцинации (особенно тем, у кого не определяются антитела к SARS-CoV-2).
2. Лицам, находившимся в контакте с больными COVID-19.
3. Переболевшим COVID-19 (особенно тем, у кого не определяются антитела к SARS-CoV-2).
4. Переболевшим ОРВИ (со схожей с COVID-19 симптоматикой).
Когда нужно тестировать Т-клеточный ответ?
Т-клеточный иммунитет развивается примерно через неделю после начала заболевания. Мы рекомендуем проверять наличие Т-клеточного ответа не ранее, чем через 14 дней после положительного теста ПЦР или вакцинации.
Какова точность данного теста?
Диагностическая чувствительность набора составляет 88,9% (71,9—96,1% с 95% доверительным интервалом), диагностическая специфичность — 95,6% (79,0—99,8% с 95% доверительным интервалом).
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Т-клеточный стартап TScan Therapeutics начал коллаборацию с компанией Qiagen для разработки теста на Т-клеточный иммунитет к COVID-19
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Споры о вакцинах и иммунитете против нового коронавируса кажутся бесконечными! От обсуждения ПЦР-диагностики и тестов на антитела дискуссии постепенно смещаются в сторону стойкости иммунитета: но измерить иммунитет человека по-прежнему сложно. Узнаем о том, как пандемия вдохнула новую жизнь в старую технологию и станет ли диагностика клеточного иммунитета доступной, в статье специалиста по Т-клеткам Софьи Касацкой.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа заняла второе место в номинации «Академия & бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Вакцинация от коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 — одна из самых горячих тем на границе 2020 и 2021 гг. Не утихают споры о безопасности вакцин, разработанных в сжатые сроки, о принципах производства и об основных принципах иммуногенности. Много спорят и о том, стоит ли добровольно прививаться тем, кто уже успел переболеть COVID-19, или, по крайней мере, подозревает об этом. Достаточно ли привиться один раз, а если вирус будет мутировать, как действовать дальше? Достаточно ли переболеть один раз или стоит бояться заболеть одной и той же инфекцией раз в сезон?
Для того чтобы ответить на эти вопросы и понять историю прошлых болезней, нужно изучить иммунную память (также ее называют иммунологической). Как правило, для проверки иммунной памяти на конкретную инфекцию проверяют наличие антител в плазме крови: ИФА-тест на антитела класса IgG (ИФА — иммуноферментный анализ). В этом тесте подсчитывается количество антител, которые сорбируются (прилипают) к стандартизированным антигенам, то есть молекулам, встречающимся именно у возбудителя данной инфекции и нигде больше. Антитела, в особенности класса IgG, поразительно точно и выборочно контактируют с однажды «выбранной» молекулой: мало где в биологии можно найти более точные и постоянные молекулярные контакты. Тем не менее тест на антитела — по большей части дань историческому процессу, а не «золотой стандарт» тестирования иммунной памяти. Пандемия стремительно изменила многие аспекты нашей жизни — может ли она поменять и то, что мы считаем стандартом в диагностике иммунитета?
Увидеть адаптивный иммунитет
«Биомолекула» неоднократно писала об уникальных механизмах, которые обеспечивают работу этой удивительной регуляторной системы — системы адаптивного иммунитета человека [1–3].
Чтобы увидеть Т-клетки и В-клетки разных типов, иммунологи чаще всего используют проточную цитометрию (FACS) [4]. Например, если мы хотим увидеть клетки памяти, то крепим флуоресцентную метку на молекулу, присутствующую только на поверхности клеток иммунной памяти, и подсчитываем клетки, пролетающие по одной через лазер и детектор флуоресценции.
Так можно узнать процент клеток, выполняющих определенную функцию, например, весь объем клеток памяти в крови на все прошлые инфекции. Теперь усложним задачу и выделим только клетки памяти на конкретную инфекцию — например, интересующий всех SARS-CoV-2, — как это сделать? Мы можем увидеть недавно активированные клетки среди клеток памяти. Лимфоциты из образца крови пациента смешиваются и инкубируются с молекулами, принадлежащими вирусу, чаще всего, — с очищенными белками, нарезанными на фрагменты. Т- и В-клетки, способные узнать и связать вирусный антиген, активируются, станут активированными эффекторными клетками, и мы сможем их различить среди всей иммунной памяти на FACS-анализе. Такие тесты проводятся в качестве дополнительных научных исследований.
Тест требует не только несколько часов на выделение клеток и их активацию вирусными белками либо пептидами, но и время дорогостоящего специалиста по проточной цитометрии, у которого прибор для FACS всегда работает и настроен, а не простаивает. Сочетание сразу двух факторов приводит к тому, что метод далеко не массовый. Можно представить метод рутинным в нескольких ведущих медицинских центрах, но сложно распространить: на порядки сложнее, чем внедрить регулярное ПЦР-тестирование.
Антитела или Т-лимфоциты
В качестве гораздо более дешевого и доступного теста, чем FACS, иммунологи смотрят не на сами клетки, а на то, что иммунные клетки производят [5]. Вспомним рецепторы, которые служат для решения задачи точного, прочного и выборочного связывания вирусных белков-антигенов. Т-клетки держат рецепторы на поверхности, на клеточной мембране. А вот В-лимфоциты свои уникальные рецепторы синтезируют как в мембранной, так и в растворимой форме — эти растворимые В-клеточные рецепторы и есть антитела. Получается, что вместо флуоресцентных меток и В-клеток памяти можно просто измерить концентрацию антител? Вдобавок, учебник иммунологии рассказывает, что В-клетки формируют память с помощью Т-клеток. Значит ли это, что если антитела есть, то уже произошло формирование памяти: сначала на уровне Т-клеток, затем на уровне В-клеток?
Да, текущие представления об иммунологии человека говорят: высокий уровень антител подразумевает, что Т-клеточный иммунный ответ тоже есть. Тем не менее известны и неклассические механизмы, при которых В-клетки быстро начинают производить антитела (чаще классов IgD, IgM) вне особых зон лимфоузла и при меньшем контроле со стороны Т-клеток. Обратная логика оказывается неверной: Т-клеточная иммунная память не зависит от наличия антител в крови, формируется независимо и сохраняется дольше.
Интуитивно кажется, что было бы отлично сохранять в крови антитела к коронавирусу после вакцинации или инфекции на всю жизнь. Некоторые инфекции формируют такой иммунный ответ, и это коррелирует с иммунной защитой, то есть вероятностью не заболеть при повторном заражении [6]. Но для других инфекций уровень антител в крови достаточно быстро, за несколько месяцев, снижается. Так происходит потому, что за свою жизнь человек встречает сотни тысяч типов вирусов, и производить антитела на все вирусные антигены просто невозможно. Приходится выбирать, происходит конкуренция с защитой от других инфекций, а также конкуренция с антителами, которые нужны для регуляции собственной физиологии организма. Антитела постепенно снижают концентрацию и пропадают из крови, но сохраняются В-клетки памяти, которые смогут вновь производить нужные антитела при необходимости.
Было бы идеально, чтобы организм производил антитела и держал их в оптимальной концентрации в крови не во время повторной болезни, а чуть заранее: до заражения. Именно для этого существуют сезонные ревакцинации: небольшая бустерная доза антигена поступает заранее и через 9–14 дней иммунитет снова подготовлен к сезонному контакту с большим количеством вирусных частиц вокруг. А постоянное, круглогодичное производство антител на высоком уровне можно оставить тем В-лимфоцитам, которые действительно каждый день сталкиваются с одними и теми же бактериями и вирусами: например, В-лимфоцитам слизистой ЖКТ, работающим с кишечными симбионтами.
ELISPOT: ИФА для Т-клеток?
Антитела оказались удобным для измерения косвенным маркером иммунной памяти, но отсутствие антител еще не говорит об отсутствии Т-клеточной памяти. Специфичную иммунную память Т-клеток, к сожалению, нельзя измерить так же легко, по нескольким миллилитрам плазмы крови. Как упоминалось выше, Т-клетки не секретируют свои рецепторы в растворимом виде. Зато Т-лимфоциты, в соответствии со своей ролью дирижеров всего иммунного ответа, вырабатывают множество сигнальных молекул — цитокинов. Цитокины, в большинстве своем, — тоже растворимые молекулы, и их концентрацию можно измерить в объеме (суммарно), либо «подсветить» с помощью флуоресцентных меток сразу при их секреции из специфичных Т-клеток (и увидеть соответствие клетка—сигнал). На этом принципе основан иммуноферментный анализ на клональных отпечатках Т-клеток, или ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot).
Как правило, Т-хелперы секретируют сигнальные цитокины, чья основная задача — активировать нужную ветвь иммунного ответа, привлечь клетки врожденного иммунитета и подавить конкурирующие сигналы. Среди функций цитокинов — подача сигналов внутри иммунной системы — от Т-клеток и для Т-клеток для уточнения принятия решений. Подобная информация «для внутреннего использования» передается и от Т-хелперов Т-киллерам, и в обратном направлении. Яркий пример такого сигнала — интерферон-гамма: активированные Т-киллеры секретируют IFNγ наравне с Т-хелперами. Массовая выработка интерферона позволяет быстро распространить информацию на уровне всего организма. На основе измерения продукции IFNγ Т-клетками разработан самый надежный из ELISPOT-тестов на антиген-специфичный Т-клеточный ответ [7], [8].
Для ELISPOT живые изолированные Т-клетки периферической крови инкубируются с антигенами, как правило, белковыми либо пептидными. Этот процесс должен имитировать то, как в организме Т-клетки в лимфоузлах узнают антигены и активируются: процесс презентации антигена. Небольшая доля специфичных клеток узнает антигены и производит IFNγ, причем интерферон сразу фиксируется и позже визуализируется в точке секреции. В процессе активации Т-клетки делятся: из одной клетки образуется целый клон антигенспецифичных клеток, все они производят интерферон, и при визуализации «пятно» продукции интерферона растет в диаметре (рис. 1). При ELISPOT сложно точно сказать, сколько антигенспецифичных клонов было изначально в образце до активации, размножения и формирования пятна. Остается неясным, сколько Т-клеток узнают антиген in vivo, но не прореагировали из-за искусственной формы презентации антигена, не похожей на то, как Т-клетки обычно активируются в лимфоузлах. С другой стороны, метод немного проще оптимизировать в лаборатории и проще делать для многих пациентов одновременно, чем более дорогостоящий FACS-анализ; требующиеся приборы и реагенты дешевле.
Рисунок 1. Схема работы теста ELISPOT, определяющего активацию Т-лимфоцитов при взаимодействии с антигенами нового коронавируса SARS-CoV-2
[11], рисунок с изменениями
Поиск коронавирусных Т-клеток. Инновация TScan
ELISPOT используется во всех лабораториях, которые исследуют иммунитет человека. Метод ELISPOT и его модификации на пересекающихся пулах пептидов (наборах фрагментов, на которые нарезается белковый антиген) использовались в исследованиях эффективности вакцин от ВИЧ, и позже медленно распространились на исследования и других вакцин. В диагностических лабораториях метод стал популярен потому, что для более точной диагностики туберкулеза необходимо оценивать Т-клеточный иммунный ответ. Коммерческий тест получил название T-SPOT. Кроме туберкулеза, для других инфекций аналогичная диагностика не применялась — до 2020 года и кризиса, вызванного новой коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2. Необходимость широкой диагностики самой инфекции и иммунной памяти к ней подтолкнула одновременно исследователей и производителей диагностических тестов к разработке новых методов и оптимизации старых и привычных. Интерес к быстрому и дешевому измерению Т-клеточной памяти растет параллельно с популярными в медиа опасениями, что у переболевших COVID-19 быстро пропадают антитела в крови.
Очень многие академические коллективы, которые работают на стыке биохимии, иммунологии человека и прикладных биотехнологий, весной 2020 года стали заниматься разработками для борьбы с пандемией, в том числе разрабатывать и налаживать диагностику инфекции. Нельзя не упомянуть пример коллектива Григория Ефимова из НМИЦ гематологии в Москве, активно работающий как над диагностикой Т-клеточного иммунитета к новому коронавирусу на основе FACS, так и в коллаборации по созданию одного из ИФА-тестов для определения антител к антигенам SARS-CoV-2 [9], [10]. Тем не менее вернемся к теме масштабируемого производства быстрых ELISPOT-тестов на Т-клеточный иммунитет: откуда берутся такие разработки, тоже из фундаментальных и клинических академических лабораторий?
Первой ELISPOT-тест на ковид (T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 assay) выпустила компания Oxford Immunotec, ранее создавшая одну из самых популярных версий теста на туберкулез [11]. Этот тест использует пул разнообразных антигенов коронавируса и активацию Т-клеток в смеси с другими лейкоцитами периферической крови: иначе говоря, дизайн теста даже несколько упрощен по сравнению с тестом на туберкулез (рис. 1).
Куда более интересную модификацию запустил небольшой биотех-стартап под названием TScan Therapeutics. Этот стартап переориентировался на инфекционную иммунологию во время пандемии. Как и многие другие коллективы, к примеру, BioNTech (разработчик вакцины от коронавируса совместно с Pfizer), до пандемии они занимались онкологией и задачей оптимальной активации противоопухолевого иммунитета.
Осенью 2020 года TScan Therapeutics подписали соглашение о совместной разработке диагностического теста ELISPOT-типа с компанией Qiagen — крупнейшим производителем лабораторных реагентов и универсальных наборов для типовых экспериментов в молекулярной и клеточной биологии [12], [13]. Эта диагностика Т-клеточной памяти во многом отличается от версии Oxford Immunotec, и в первую очередь отличается идеологически: оксфордская компания быстро и практично сделала аналог своего существующего продукта-бестселлера, сохранив всю платформу и протокол метода и изменив только антиген. TScan же демонстрирует почти идеальный инновационный подход: вначале провели исследования Т-клеточного иммунитета, опубликовали выводы в престижном журнале Immunity, затем появилась идея для диагностического теста и, наконец, возможность производства в партнерстве с Qiagen.
Исследование TScan раскрывает детали того, какие молекулы среди белков коронавируса вызывают наибольший «интерес» у Т-клеток человека [14]. Иммунная память Т-киллеров, согласно исследованию, формируется не только и не столько на фрагменты антигена (эпитопы) S-белка коронавируса, на котором сфокусировано большинство вакцин 2020 года [15]. Напротив, эпитопов гораздо больше в нуклеокапсидном основном белке [16]. Далее, специалисты TScan показали отсутствие перекрестного иммунитета: антигены «сезонных» неопасных человеческих коронавирусов формируют память Т-киллеров, но эти Т-киллеры не способны отреагировать на коронавирус SARS-CoV-2. Наоборот, между SARS-CoV-1 (вызвавшим вспышку атипичной пневмонии в 2003 году) и SARS-CoV-2 существует значительная кросс-реактивность Т-клеток (переболевшие атипичной пневмонией могут быть защищены от SARS-CoV-2).
Обнаружение важнейших участков вируса, вызывающих долгую Т-клеточную память — это поиск иммунодоминантных эпитопов. Если активировать Т-клетки именно такими пептидами, можно существенно повысить качество диагностического теста. Уникальные данные TScan позволяют вычесть фон иммунной памяти на родственные и далекие коронавирусы и поднять специфичность диагностики иммунной памяти. При этом используется платформа, сходная с ELISPOT, что позволяет объединять много образцов и делать тест быстрым и широко доступным. Сейчас исследования Т-клеточного иммунитета при коронавирусе проводится либо в рамках научных исследований, либо на коммерческой основе, но точность и интерпретация теста затруднена, клиент получает результат через 1–2 неделю после теста. Партнерство TScan с Qiagen вселяет оптимизм по поводу доступности теста: ведь продукцией этой компанией пользуются буквально в каждой молекулярной и биохимической лаборатории на планете.
Интересна еще одна деталь. Исследователи из TScan брали донорские Т-клетки у доноров с наиболее распространенными в США генотипами других важных иммунных молекул: молекул HLA (молекул главного комплекса гистосовместимости, Human Leukocyte Antigen) подтипов HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02 и HLA-B*07:02. В зависимости от типа молекул HLA Т-клетки будут распознавать разные эпитопы одного и того же вируса. А поскольку у разных людей максимально вариабельные молекулы HLA, то и иммунный ответ Т-клеток у каждого формируется максимально индивидуально. Именно с этим связаны и сложности/дороговизна изучения Т-клеточного иммунитета, и невозможность «перелить иммунную память» переливанием крови — такой эксперимент может получиться только внутри пары однояйцевых близнецов. С другой стороны, даже в этом огромном разнообразии реакций клеточного иммунитета Т-клетки разных доноров, отвечающие на новый коронавирус, обладают некоторыми общими характеристиками.
Данные об общих параметрах иммунного ответа, которые будут накапливаться в совместных исследованиях TScan/Qiagen, представляют несомненный интерес для оптимизации лечения пациентов и создания методов лечения, таргетно направленного на активный и безопасный Т-клеточный ответ. Здесь проявляется особая черта сильных deeptech-стартапов в области биологии, биоинформатики и биотехнологий: технологическая платформа может быть использована не только для одного применения и быстрого завоевания рынка, а для разных задач, и в процессе, по ходу решения прикладной задачи возникают ценные, качественные и заметные научные открытия. Конечно, новость о сотрудничестве TScan и Qiagen — всего лишь одна из множества историй о биотех-прорывах 2020 года, и легко могла затеряться среди других новостей и инноваций. Но в этой неприметной новости заложен мощный потенциал, способный изменить современные представления о клинической диагностике иммунной памяти.
