НЕФЕРМЕНТИРУЮЩИЕ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ
Неферментирующие грам-отрицательные бактерии — гетерогенная группа бактерий, не вызывающих процессов брожения.
Большинство Неферментирующих грамотрицательных бактерий, исследуемых в бактериол. лабораториях, следует рассматривать как условно-патогенные микроорганизмы (см.). Частота их выделения из клин, материала и объектов окружающей среды составляет ок. 15%. Неферментирующие грамотрицательные бактерии относятся к различным таксономическим подразделениям, они встречаются среди представителей рода Agrobacterium — A. radiobacter, рода Acinetobacter — A. calcoaceticus (син. Hereljea vaginicola, Bacterium anitratum, Moraxella lwoffi), рода Alcaligenes — A. denitrificans, A. faecalis (син. A. odorans), A. xylosoxidans (син. Achromobacter xylosoxidans), рода Bordetella — B. bronchiseptica (син. B. bronchicanis), рода Flavobacterium — F. meningosepticum, F. odoratum, рода Flavobacter — F. breve, F. multvo-rum, F. spiritivorum, рода Kingella — K. kingae, K. denitrificans, K. indologenes, рода Moraxella — M. bovis, M. lacunata (син. M. liquefaciens), M. atlantae, M. nonliquefaciens, var. oxidans, M. osloensis, M. phenylpyruvica, M. urethralis, более 20 видов рода Pseudomonas — Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. mallei, Ps. pseudomallei, Ps. putida и др.
Неферментирующие грамотрицательные бактерии не образуют спор, многие имеют капсулу. Среди них встречаются как подвижные, так и неподвижные бактерии. У моракселл и ацинетобактера описана своеобразная «дергающая» подвижность. Многие Н. г. б. хорошо растут на обычных питательных средах. Колонии флавобактерий и нек-рых псевдомонад пигментированы. Большинство Н. г. б. утилизирует органические соединения путем окисления без образования газообразных продуктов; все Н. г. б. не продуцируют ацетилметилкарбинола. За исключением ацинетобактера и нек-рых видов псевдомонад, эти бактерии оксидазоположительны. Эйкенеллы и кингеллы не образуют каталазы. Н. г. б. являются строгими аэробами, хотя нек-рые псевдомонады и ацинетобактер способны к анаэробному росту в присутствии нитратов. Флавобактерии и кингеллы обладают слабой ферментативной активностью. Среди Н. г. б. определяются как высокочувствительные к антимикробным агентам, так и устойчивые к ним штаммы. Устойчивость часто контролируется плазмидными генами (см. Плазмиды). Многие Н. г. б. обладают повышенной чувствительностью к высокой температуре, но радиорезистентны. Содержание гуанин + цитозин в ДНК этих микроорганизмов колеблется в пределах 31—74,5 молъ%.
Главные места обитания Н. г. б.— вода и почва; выделяют их и из пищевых продуктов, подвергнутых замораживанию или воздействию ионизирующего излучения, а также обнаруживают в организме здоровых людей и животных.
В патогенезе заболеваний, вызываемых Н. г. б., основная роль принадлежит эндотоксинам. Эти бактерии часто вызывают лизис эритроцитов, как обусловленный продукцией гемолизинов, так и не связанный с ними. При заболеваниях человека Н. г. б. составляют до 20% от общего числа выделяемых гемокультур, почти в 10% случаев выделяются из желчи и мочи у лиц с поражениями желчевыводящей и мочеполовой систем. Ок. 7% культур, выделяемых при глазных инфекциях, являются Н. г. б. Увеличивается число пневмоний, менингитов, послераневых инфекций и других заболеваний, вызываемых этими бактериями. Внутрибольничные инфекции, связанные с Н. г. б., нередко заканчиваются летально.
Библиогр.: Литовченко П. П. и Заботина И. В. Морфологические, культуральные и биохимические свойства культур синегнойных бактерий, выделенных от больных людей, животных и из объектов внешней среды, Журн. микр., эпид. и иммун-, № 5, с. 78, 1981; Шендеров Б. А. и Серкова Г. П. Неферментирующие грамотрицательные бактерии, Сообщ. 2, Moraxella, там же, № 3, с. 14, 1979; они же, Неферментирующие грамотрицательные бактерии, Сообщ. 3, Acinetobacter, там же, № 5, с. 9; они же, Простые схемы идентификации неферментирующих грамотрицательных бактерий, в кн.: Вопр. биохимии и физиол. микроорганизмов, под ред. В. В. Игнатова и др., в. 8, с. 60, Саратов, 1980; Holmes В., Owen R. J. a. Hollis D. G. Flavobacterium spi-ritivorum, a new species isolated from human clinical specimens, Int. J. system. Bact., v. 32, p. 157, 1982; Manual of clinical microbiology, ed. by E. H. Lennette a. o., p. 263, 288, Washington, 1980; Owen R. J. a. Jackman P. J. H. The similarities between Pseudomonas pau-cimobilis and allied bacteria derived from analysis of deoxyribonucleic acids and electrophoretic protein patterns, J. gen. Micros biol., v. 128, p. 2945, 1982; Yabuuchi E., Yamanaka K. a. Ohyama A. Evaluation of 36 Minitek tests and a new approach for identification ofnonfer-menters, J. clin. Microbiol., v. 13, p. 572, 1981.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОРСКИХ ПСЕВДОМОНАД, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЙОНОВ С РАЗНОЙ СТЕПЕНЬЮ АНТРОПОГЕННОЙ НАГРУЗКИ
Известна их широкая приспособляемость к условиям среды и жизнестойкость. Они обладают широким спектром ферментов и плазмид способствующих в приспособлении их к изменяющимся условиям существования. Известно, что псевдомонады способны продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов, в том числе антибиотиков.
Бактерии этого рода способны выдерживать мощный антропогенный пресс. Загрязнение водоемов химическими токсическими соединениями, в том числе с мутагенным и генотоксическим действием, влияет не только на состав микробных ценозов, но и приводит к изменениям в генетическом аппарате и соответственно эколого-физиологических свойств собственно микроорганизмов (Цыбань, 2000).
Экологические и эпидемиологические последствия этих изменений еще не определены, но можно предположить, что генетические перестройки способствуют адаптации к химическим элементам и определяют искусственную микроэволюцию микроорганизмов. Подобные приспособления могут сопровождаться приобретением микроорганизмами признаков, представляющих опасность для гидробионтов, наземных организмов и человека.
Поэтому цельюданной работы является: изучение патогенных свойств бактерий рода Pseudomonas, выделенных из морской среды с разной степенью загрязнения.
Для достижения этой цели необходимо выполнить следующие задачи:
Выделить штаммы микроорганизмов рода Pseudomonas из районов с разной степенью антропогенного пресса.
Исследовать патогенные свойства выделенных штаммов псевдомонад.
Дать сравнительную характеристику факторов патогенности псевдомонад, выделенных из районов с разной степенью антропогенного загрязнения.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Классификация и краткая характеристика отдельных видов бактерий рода Pseudomonas
1.1.1 Классификация
Классификация семейства Pseudomonadaceae в последние годы претерпела значительные изменения. Современная классификация псевдомонад основана на методах молекулярной гибридизации и куль-туральных особенностях микроорганизмов. Некоторые бактерии рода Pseudomonasсравнительно недавно получили новое наименование — Burkholderia.
Современная и предшествующая классификация представителей семейства Pseudomonadaceae в сокращенном варианте представлены в табл.1. (Сидоренко и др., 1999).
Современная классификация (по гомологии рРНK [2, 3])
Род Pseudomonas (I группа)
Pseudomonas pseudoalcaligenes и др.
Pseudomonas pseudoalcaligenes и др.
Род Burkholderia (II группа)
Burkholderia cepacia и др.
Pseudomonas cepacia и др.
Род Comamonas (III группа)
Comamonas terrigena и др.
Pseudomonas terrigena и др.
Род Brevundimonas (IV группа)
Род Stenotrophomonas (V группа)
Роды с неясной рРНK гомологией
Псевдомонады неизвестной гомологии
В последнее десятилетие появились фундаментальные исследования, касающиеся таксономической характеристики отдельных групп и видов бактерий рода Pseudomonas. В этих работах подробно описываются различные морфологические, культуральные и физиолого-биохимические признаки некоторых групп, видов или отдельных представителей бактерий этого рода. Представлена таксономическая характеристика 202 штаммов, относящихся к 28 видам псевдомонад. Эти бактерии были разделены на три группы на основании характеристики образуемых ими пигментов.
Флуоресцирующие бактерии. Эта группа объединяет представителей 12 видов бактерий. Все они синтезируют водорастворимые флуоресцирующие пигменты от желто-зеленого, до оранжевого оттенка. Некоторые из них образуют синий пигмент, нерастворимый в воде. Бактерии этой группы активно разлагают углеводы. При росте на средах с гексозами образуют кислоты; на средах с лактозой и крахмалом не развиваются. Потребляют органические кислоты, растут на средах с ароматическими соединениями; аэробы. Восстанавливают нитраты до нитритов. Сероводород и индол не образуют. Распространены в воде, почве, сточных водах.
Ахромогенные бактерии. В эту группу входят бактерии, которые не синтезируют пигментов. Используют сахара, органические кислоты. Восстанавливают нитраты до нитритов. Сероводород и индол не образуют. Выделены из пищевых продуктов (пива, мяса).
Хромогенные бактерии. Эта группа объединяет бактерии 6 видов, выделенных из почвы. Фитопатогенных форм среди них нет. Все бактерии образуют желтый пигмент, нерастворимый в воде; аэробы, восстанавливают и потребляют нитраты, гидролизуют крахмал, образуют сероводород и индол.
Результаты, полученные при сравнении способности использовать различные углеродные соединения, подтверждают правильность разделения бактерий рода Pseudomonas на три группы по признакам пигментации. Все штаммы, отнесенные к флуоресцирующей группе, имеют общие свойства: подкисляют среду при использовании глюкозы, потребляют глюконат, разлагают ароматические соединения, обладают высокой активностью фермента цитохромоксидазы. Всех этих свойств у бактерий, отнесенных к ахромогенной и хромогенной группам, обнаружено не было. Следовательно, существует явная корреляция между характером углеводного обмена бактерий рода Pseudomonas и их пигментацией.
Существует так же таксономическое разделение на группы бактерий рода Pseudomonas на основе их физиолого-биохимических свойств. Изучено 267 штаммов, принадлежащих к 10 видам. Значительная часть таксономических данных была получена путем применения метода, предложенного Дюреном де Йонгом (1926), который заключался в детальном изучении пищевых потребностей у большого количества бактерий. У каждого штамма изучали способность использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 146 органических соединений. Были изучены углеводы, жирные кислоты, органические кислоты, спирты, ароматические соединения, не содержащие азота в кольце, а также углеводороды.
Кроме того, исследовались: потребность бактерий в источниках азота, ростовых факторах, способность к денитрификации и другие физиолого-биохимические признаки.
Цитологические наблюдения включали исследования размера клеток, характера жгутикования, окраску по Граму, образование включений и т. п.
Полученные данные позволили разделить бактерии рода Pseudomonas на три группы: флуоресцирующую, кислотоиспользующую и щелочеобразующую.
В группу флуоресцирующих бактерий включены бактерии, относящиеся в основном к трем видам (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida), и несколько представителей других видов. Все они синтезируют водорастворимый желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, используют нитраты или соли аммония как источники азота, не образуют поли-β-масляную кислоту в качестве резервного материала в клетках.
Эта группа бактерий делится на семь различных биотипов в зависимости от некоторых специфических признаков: способности синтезировать пигменты феназинового типа, образовывать леван из сахарозы, а также по наличию сильных денитрифицирующих свойств.
Кислотоиспользующие бактерии не синтезируют пигментов; они аэробы, лофотрихи. Все образуют в клетках поли-β-оксимасляную кислоту в качестве резервного материала. Кроме этих признаков, описаны некоторые другие свойства, характерные для определенных штаммов, а не для групп бактерий (Колесникова, 1974).
1.1.2 Характеристика представителей различных видов псевдомонад
Классический представитель рода Pseudomonas. Выраженный хемоорганотроф, строгий аэроб. Основной возбудитель инфекционных поражений человека.
Распространена повсеместно, ее выделяют из почвы, воды, с растений и от животных (водных или обитающих в ареалах с повышенной влажностью). Вода имеет значение в циркуляции бактерии, в ней она может выживать до года (при 37 о С), в том числе во многих растворах, применяемых в практической медицине. Иногда входит в состав нормальной микрофлоры человека.
По сравнению с другими видами псевдомонад эти формы наиболее интенсивно исследуются бактериологами, изучающими патогенную группу, и фитопатологами.
Бактерии Ps. aeruginosa обладают особым разнообразием свойств, но, в то же время, у них отмечаются характерные общевидовые морфологические и физиологические признаки. Клетки бактерий представляют собой мелкие палочки (1,0-1,5 × 0,5 мкм), одиночные или соединенные в пары; имеют один-два, редко три полярно расположенных жгутика, грамотрицательные. Растет в широком диапазоне температур (4-42 о С). Хорошо растет на простых питательных средах в аэробных условиях при температуре 30-37С. Характерная особенность – образование слизи. Среди этих бактерий встречаются подвижные и неподвижные формы.
Сильно выражена протеолитическая активность. Разжижают желатин, свертывают сыворотку крови, гидролизуют казеин; утилизируют гомоглобин. Синтезируют гиалуронидазу; нитраты восстанавливают до нитритов и далее до молекулярного азота.
Низкая сахаролитическая активность; окисляют только глюкозу с образованием глюконовой кислоты.
Культуры образуют синий флуоресцирующий пигмент, в состав которого входят пиоцианин; зеленый пигмент – флюоресцеин. Некоторые штаммы могут синтезировать и другие пигменты – пиорубин (красный), пиомеланин (черно-коричневый), L-оксифеназин (желтый). Качественный состав пигментов и их количественный набор зависят от условий культивирования, немалое значение имеет и экологический фактор.
Повсеместно распространенный организм, экология и эпидемиология которого имеет много общего с таковыми у Pseudomonasaeruginosa, но проявляющий меньшую вирулентность.
Подвижная полиморфная палочка, снабженная 3-8 полярно расположенными жгутиками (лофотрихи).
Окисляет глюкозу, лактозу, мальтозу и маннит. По Граму часто окрашивается биполярно. Выделение требует рпименение селективных сред; температурный оптимум 30 о С; на кровяном агаре с полимиксином В образует выпуклые мутные маслянистые беловато-серые колонии. Некоторые штаммы синтезируют метиламин, придающий культурам сладковатый запах. Возможно образование желтого или зеленоватого нефлюорисцирующего феназинового пигмента, растворимого в воде и хлороформе (Покровский и др., 1999).
Возбудитель сапа – инфекционного заболевания человека и животных.
Бактерии не устойчивы к действию факторов внешней среды; прямой солнечный свет убивает его за 24 часа. Термолабилен.
Тонкие, слегка изогнутые палочки с закругленными концами размером от 0,5-1 до 2-3 мкм. Склонны к полиморфизму (образование более мелких форм либо цепочек). Неподвижны. Не образуют спор. Строгий аэроб.
Растет на простых средах, температурный оптимум 37 о С, pH 6,5-7,2. Хорошо переносит низкие температуры. Образует плоские полупрозрачные колонии. Пигментообразование возможно только на картофельной среде.
Некоторые штаммы разлагают глюкозу, манит, левулезу, глицерин с синтезированием кислоты без газа; не восстанавливают нитраты. Молоко свертывают медленно, не пептонизируют его. Синтезируют H2S и аммиак на жидких средах; каталаза-положительны. Продуцирует эндотоксин.
Сравнительно не стойкие: погибают после кипячения, после высушивания. Не стойки к применению дезинфицирующих средств (Вольпе и др., 1967).
Возбудитель зоонозов, у человека вызывает мелиоидоз. Представляет собой грамотрицательную палочку размером от 0,5-1 до 2-6 мкм с закругленными концами и парным расположением в мазках. Иногда образует нитевидные формы. Обладает подвижностью, которая исчезает в старых культурах. 1-4 жгутика на одном или обоих концах палочки (Вольпе и др., 1967).
Характерным признаком является образование, которое напоминает капсулу; спор не образует.
Хорошо растет на обычных питательных средах. Факультативный аэроб. Температурный оптимум роста – 37 о С.
Утилизируют углеводы, аминокислоты, сложные спирты и ароматические соединения в качестве источников углерода и энергии, не образуют кислоты при сбраживании глюкозы (Вольпе и др., 1967).
Большинство штаммов разлагает глюкозу, лактозу, сахарозу, манит, мальтозу и дульцит, свертывает лакмусовое молоко, пептонизирует его, разжижает желатин, растворяет яичный белок. Протеолитические свойства выражены сильнее, чем у mallei. Продуцирует каталазу, не образует сероводорада и индола. Ферментативная активность отдельных штаммов резко варьирует.
В фильтрате старых бульонных культур содержится токсическое вещество, сходное с эндотоксином. В составе токсина различают факторы: летальный, некротический, а также фактор, вызывающий отек и покраснение кожи. Экзотоксин не обнаружен. Вирулентные свойства палочки мелиоидоза являются довольно стойкими и сохраняются годами при пересевах на искусственных питательных средах (Покровский и др., 1999).
Грамотрицательные подвижные палочки размером 2-3·0,6-0,8 мкм, спор не образует. На агаризованной питательной среде из кислотного гидролизата рыбной муки на вторые сутки образуются плоские, матовые колонии диаметром 2-3 мм. В бульоне из кислотного гидролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.
Трансформирует ТНТ кометаболически в присутствии цитрата, сукцината.
Не патогенен (не вирулентен, не токсичен, токсигенностью не обладает).
Продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфак-танты). Хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона и ферментативного гидролизата рыбной муки, на синтетических питательных средах, где в качестве источника углерода используются сахароза, пируват, меласса.
Другие виды псевдомонад
К виду Ps. aeruginosa близко примыкают бактерии Ps. schuilkilliensis, которые синтезируют сине-зеленый флуоресцирующий пигмент, диффундирующий в субстрат; температурный оптимум развития около 37 °С. Желатин разжижают медленно.
Культуры Ps. syncyanea образуют сине-зеленый флуоресцирующий пигмент. Желатин неразжижают, нитраты не восстанавливают; аэробы. Температурный оптимум развития около 25°С.
Ps. scissa. Клетки мелкие (1,0×0,3мкм, подвижные. Бактерии образуют желто-зеленый флуоресцирующий пигмент. Желатин не разжижают, молоко не изменяют, нитраты восстанавливают до нитритов; аэробы. Оптимум температуры роста около 27 °С. Эти псевдомонады были выделены из воды и почвы. К виду относятся 6 различных штаммов бактерий, обладающих сходными свойствами.
Ps. atlantica. Клетки мелкие, подвижные, с полярным жгутиком; колонии гладкие, блестящие. Культура энергично разжижает агар-агар и желатин, молоко пептонизирует, крахмал разлагает, нитраты не восстанавливает. Бактерии относятся к аэробам. Оптимальная температура роста около 25 °С. Эти псевдомонады были выделены из морской воды (Атлантический океан).
Ps. fluorescens. Мелкие палочки (1-2 × 6 мкм); подвижные; имеют 2-4 полярных жгутика. Бактерии грамотрицательные. Культуры бактерий образуют зеленовато-желтый флуоресцирующий пигмент, который проникает в субстрат. Представители этого вида не синтезируют пиоцианин; хорошо развиваются на органических и синтетических средах. Колонии бесцветные или белые, выпуклые, гладкие, блестящие. Характерной особенностью этого вида является внешняя микроструктура колоний: при малом увеличении микроскопа поверхность колоний имеет характерное сетчатое или ячеистое строение. В бульоне бактерии образуют муть и пленку. Желатин разжижают, молоко не свертывают, нитраты восстанавливают до нитритов, образуют кислоту на глюкозе и сахарозе; аэробы. Оптимальная температура роста около 25 °С. Бактерии часто встречаются в воде, почве, на разных растительных и животных субстратах; не патогенны для животных.
Особое место занимает вид Ps. aurantiaca. Описание морфологических, культуральных и некоторых физиологических свойств бактерий этого вида встречается в основном в работах советских исследователей. Клетки бактерий этого вида палочковидные, 2-3 × 0,6 мкм, подвижные, имеют на конце 2-5 жгутиков. Колонии на питательных средах окрашены в оранжевый или красно-желтый цвет, гладкие, блестящие, плоские или выпуклые. Пигмент диффундирует в субстрат. Культуры хорошо растут на обычных питательных средах; желатин разжижают, молоко пептонизируют. Кислоту образуют при росте на глюкозе, сахарозе, манните, глицерине. Нитраты не восстанавливают, крахмал не разлагают, аэробы. Оптимальная температура роста около 25 °С. В состав оранжевого пигмента входит несколько веществ различной химической природы.
Ps. stutzeri. Грамотрицательные бактерии. Распространены в почве, воде и больничной среде. Растут в анаэробных условиях на средах, содержащих нитраты (образуют свободный азот), на средах с аммонием в качестве источника азота и ацетатом в качестве источника углерода, подвижны (монотрихи).
Ps. (Commamonas)acidovorans. Не выделяют кислоты при сбраживании глюкозы, подвижны (лофотрихи).
Ps. diminuta. Проявляют слабую биохимическую активность, способны ферментировать первичные спирты с образованием кислоты, подвижны (монотрихи) (Красильников,1949).
1.2 Распространение и морфологические признаки бактерий рода Pseudomonas
1.2.1 Распространение псевдомонад
Бактерии рода Pseudomonas широко распространены в природе. Их можно встретить в воздухе, почве, морских и пресноводных водоемах, сточных водах и иле, нефти и на газовых месторождениях. Псевдомонады были обнаружены на пищевых продуктах, телах животных, растениях, а также в гнойных ранах и эксперементах больных млекопитающих. Такое распространение основано на способности усваивать самые разнообразные по природе соединения и расти в различных экологических условиях. Известна их широкая приспособляемость.
Сравнительное изучение псевдомонад, выделенных из почв и морской воды, показало, что морские виды отличаются большой галотолерантностью, баротолерантностью и строением клеточной стенки, в которой меньше гексазомина, чем у пресноводных штаммов (Мишустина, 1985).
Однако исследования различных ученых показали, что псевдомонады одного вида, выделенные из географически разделенных водоемов, отличаются по своим свойствам. Большое значение в минерализации органического вещества в почве имеют широко представленные в ней псевдомонады. Почвы различных типов и различных географических зон, в том числе и почвы Антарктиды содержат представителей этого рода (Рубан, 1986).
Псевдомонады являются обычным компонентом ризосферы растений. Многие виды псевдомонад развиваются на поверхности высших растений, часто они являются фитопатогенными (Рубан, 1986).
В пластовых водах нефтяных месторождений, а так же в почвах, загрязненных нефтью, найдены псевдомонады.
Рудные месторождения пригодны для развития псевдомонад, которые принимают участие в превращении минералов. Используя низкие концентрации органических веществ, присутствующих в месторождении, они выделяют органические и аминокислоты и другие вещества и тем способствуют растворению и выносу минералов и их компонентов (Каравайко и др., 1979). Горячие источники тоже могут служить местом обитания псевдомонад.
Широкая распространенность псевдомонад обеспечивает их способность развиваться в самых различных условиях в природе, используя самые разные соединения углерода и азота в энергетическом и конструктивном обмене. Различия в физиологии отдельных видов псевдомонад позволяют отдельным представителям этого рода расти или сохранять жизнеспособность и в экстремальных условиях.
1.2.2 Морфология и строение
По Красильникову, бактерии рода Pseudomonas монолитны по морфологическим и очень разнообразны по культуральным и физиологическим признакам.
Клетки многих видов подвижны, особенно в молодых культурах. Органами движения являются жгутики. У большинства видов этого рода жгутики полярные, одиночные, лишенные чехла. Некоторые виды обладают полярно расположенным пучком жгутиков (Ps. viridiflava). У многих видов жгутики одеты в чехлы. Иногда жгутики располагаются латерально, и тогда они короче, чем полярные. У старых культур латеральный жгутик иногда заменяется полярным. Ps. mallei не имеет жгутиков и относится к роду Pseudomonas на основании других признаков. Жгутики псевдомонад обычно превышают длину клетки в несколько раз и различаются по диаметру (Рубан, 1986).
Кроме жгутиков у морских псевдомонад на поверхности имеются трубчатые отростки – шипы (спины) длиной 1 – 3 мкм и диаметром 65 нм.
У многих псевдомонад на поверхности клеток имеются тонкие прямые реснички – фимбрии или пили. Иногда они располагаются по всей поверхности клеток, но у многих видов они расположены полярно.
Оболочка клеток псевдомонад состоит из девяти слоев, в которые входит внешняя мембрана толщиной 7 нм, мукопептидный слой, толщиной до 9 нм, периплазма и цитоплазматическая мембрана, толщиной 7 нм.
Толщина клеточной оболочки у псевдомонад может меняться под влиянием внешних факторов и быть различной у разных штаммов. Состав липополисахаридов не влияет на строение клеточной стенки.
Химический состав клеточной стенки бактерий постоянен и, как правило, не изменяется на различных стадиях развития культуры или при возникновении мутаций. Поэтому он является признаком для таксономической характеристики рода. Например у псевдомонад процент Г + Ц (гуанин + цитозин) в ДНК колеблется в пределах 58-69%.
Цитоплазма – содержимое клетки, не является гомогенным белковым раствором, а пронизана мембранными и тубулярными структурами. В ней находятся рибосомы и нуклеоид.
Лизосомы относятся к спиральному типу и локализованы в области клеточного деления или у полюсов клетки.
В цитоплазме находятся включения запасных веществ в виде капель и гранул (Рубан, 1986).
Колонии бактерий очень разнообразны: слизистые и пастообразные, выпуклые и плоские, крупные и мелкие. У многих видов отмечается внутренняя структура колоний. Если их рассматривать в микроскопе при малом увеличении, то в одних случаях можно обнаружить мелкозернистую колонию; в других — ячеистую, напоминающую соты; в третьих — колонии в виде мелких комочков или зерен.
Большинство видов имеет колонии без внутренней структуры — под микроскопом они выглядят как однородная гомогенная масса. Цвет колоний желтый, оранжевый, белый, иногда они опалесцируют.
Культуры различаются между собой способностью разлагать белки, использовать углевод, расщеплять крахмал, клетчатку, углеводороды, соединения ароматического ряда и другие сложные по составу вещества.
Большинство бактерий рода Pseudomonas обладает гетеротрофным типом обмена веществ, т. е. для построения тела им требуется готовое органическое вещество. Биосинтетические процессы при этом осуществляются за счет обмена окислительного типа, где кислород является конечным акцептором электронов, перенос которых связан с системой цитохромов. Некоторые представители этого рода могут существовать за счет анаэробного нитратного дыхания, другие используют энергию окисления водорода. Многие виды псевдомонад образуют пигменты, различные по окраске и химической природе; некоторые синтезируют витамины, антибиотики, токсины.
Среди представителей бактерий рода Pseudomonas есть формы, токсичные для животных организмов (патогенные бактерии). Имеется также немало фитопатогенных видов, поражающих растения (Смирнов и др., 1990).
1.3 Влияние различных факторов среды на размножение бактерий
Важнейшей физиологической особенностью микроорганизмов является их способность адаптироваться к различным условиям окружающей среды – низкой температуре и высокому давлению, повышенной концентрации солей и различным токсическим веществам неприродного происхождения и т.д.
Большинство факторов внешней среды оказывают решающее влияние на характер метаболизма клетки, в первую очередь, действуя на скорость различных ферментативных реакций или целостность клеточной организации. Изменение этих факторов неизбежно приводит к перестройке клетки, как единой функционирующей системы, и время, требуемое для такой перестройки, является периодом адаптации.
Основными из этих факторов среды являются:
2) концентрация водородных ионов;
3) окислительно-восстановительный потенциал;
4) состав газовой фазы;
5) осмотическое и гидростатическое давление;
6) ионная сила жидкой фазы;
7) уровень радиации
Микроорганизмы обладают способностью нормально функционировать в относительно широком диапазоне изменений этих факторов окружающей среды. Однако для любого из этих факторов имеются экстремальные точки, приближение к которым приводит к угнетению жизнедеятельности, а достижение вызывает гибель данного микроорганизма.
1.3.1 Влияние температуры на рост псевдомонад
Температурные границы для развития большинства видов псевдомонад довольно широки (4 – 43 0 С). Многие виды этого рода являются мезофилами и развиваются при 27-30 0 С. Но встречаются темофильные и психрофильные штаммы (некоторые развиваются даже при отрицательных температурах). Последние обладают большой устойчивостью процесса синтеза белка к низким температурам и высокой активностью гидролитических ферментов (Рубан, 1986).
Не обладая способностью образовывать покоящиеся формы типа спор, цист, псевдомонады выдерживают длительное обезвоживание без потери жизнеспособности.
1.3.2 Влияние гидростатического давления на рост псевдомонад
При изучении действия гидростатического давления в 686,8*10 5 Па на бактерии было установлено, что синтез белка осуществляется или задерживается в этих условиях у разных микроорганизмов независимо от их места обитания, физиологической или таксономической группы. На способность синтезировать белок в большей или меньшей степени при высоком гидростатическом давлении влияет количество 30 S рибосом (Рубан, 1986).
При культивировании в условиях высокого гидростатического давления баротолерантный штамм Ps. аeruginosa, выделенный из Курило-Камчатской впадины, образует внеклеточные кето- и аминокислоты. Скорость роста и синтеза белка падают по мере повышения давления. При нормальном 1,01*10 5 Па давлении в культуральной жидкости накапливается аланин, при 202*10 5 Па в среду выделяется валин, при 505*10 5 Па аминокислоты не накапливались. При всех испытанных давлениях в среду выделялись пировиноградная, 2-кетоглютаровая и щавелевоуксусная кислоты.
1.3.3 Влияние кислорода на развитие псевдомонад
Псевдомонады строго аэробны, за исключением видов, способных осуществлять процесс денитрификации, при котором нитраты являются для них конечным акцептором электронов.
Облигатная аэрофильность многих представителей псевдомонад обуславливает их развитие в поверхностных слоях воды естественных водоемов.
Рост и дыхание клеток псевдомонад имеют собственные пороговые значения концентраций растворенного кислорода. Замедление роста культур многих видов псевдомонад замедляется при снижении концентрации растворенного кислорода на 30-50% от насыщения, а критическая концентрация в среде для дыхания составляет 11-17% от насыщения. Следовательно, критическая концентрация кислорода для роста выше, чем для дыхания, в 2 – 3 раза.
В некоторых случаях можно заменить кислород воздуха такими «концентраторами кислорода», как перекись водорода.
Многие микроорганизмы при переходе в стационарную фазу роста обнаруживают цианидрезистентное дыхание. Так как обычное дыхание и потребление кислорода резко подавляется цианидом, для объяснения этого явления были предприняты исследования, показавшие, что цианид не подавляет специфическую оксидазу, локализованную в цитоплазматической мембране клеток. Этот фермент акцептирует электроны на участке убихинон-цитохром в основной дыхательной цепи. Цианидрезистентное дыхание не сопровождается образованием перекиси водорода
1.3.4 Влияние двуокиси углерода на рост псевдомонад.
Подавляющее действие двуокиси углерода при повышенном ее содержании в среде показано для многих микроорганизмов, в том числе и для нескольких видов псевдомонад.
Но подавление их роста бактерий неполное и достигается при относительно низких парциальных давлениях этого соединения. С понижением температуры степень ингибирования роста возрастает у всех видов, кроме нефлюорисцирующего штамма. Эндогенное дыхание не подавляется углекислым газом, а низкие концентрации его даже стимулируют этот процесс.
Влияние двуокиси азота на рост псевдомонад зависит от особенностей обмена штамма, состава среды и температуры культивирования.
При культивировании микроорганизмов в жидких средах происходит растворение двуокиси углерода в культуральной жидкости и частичное выделение в газообразной форме.
Транспорт углекислого газа через среду изменяется во времени. Уровень его десорбции зависит от концентрации газа в среде, а она, в свою очередь, находится в равновесии с парциальным давлением выделенного газа.
Итак, отношения гетеротрофных видов псевдомонад к двуокиси углерода сложны и определяются спецификой обмена отдельных видов, составом среды, температурой культивирования и соотношением растворенной и газообразной углекислоты. Хемоавтотрофные виды псевдомонад используют двуокись углерода для синтеза веществ клетки (Кондратьева, 1983).
1.3.5 Адаптация микроорганизмов к антропогенному загрязнению
В последние годы большое внимание уделяется изучению механизмов адаптации микроорганизмов к новым физико-химическим условиям, складывающимся в природных средах под влиянием антропогенных факторов. Воздействие загрязняющих веществ в условиях современного состояния Мирового океана превратилось в мощный эволюционный фактор. Присутствие в морской среде разных минеральных и органических веществ, в том числе ксенобиотиков, создает предпосылки для возникновения изменчивости морских микроорганизмов и приводит за счет направляющего отбора к активному развитию популяций, которые, адаптировавшись к новым химическим условиям, вытесняют из экосистемы другие, не приспособившиеся к воздействию чужеродных веществ, организмы (Цыбань, 2000).
Вся литература о биологических процессах в океане свидетельствует о появлении в хронически загрязненных районах морской среды доминирующих микроорганизмов, которые получили название индикаторных. И есть основания полагать, что распространение и массовое развитие этих индикаторных форм относится к числу важнейших биологических откликов на химическое загрязнение Мирового океана. Биологическая целесообразность появления индикаторных видов определяется их особым назначением: они заполняют «бреши» в биоценозах, образовавшиеся в результате негативного антропогенного воздействия и помогают их восстановлению, участвуя, таким образом, в сохранении устойчивости морских экосистем.
Микроорганизмы способны утилизировать все имеющиеся в природе органические вещества, причем необходимые для этого ферменты синтезируются в их клетках по мере необходимости. Благодаря этому микроорганизмы быстро реагируют на появление в морской среде новых химических соединений природного или антропогенного происхождения. Так, например, в настоящее время широко известен феномен резкого увеличения численности (на 3-5 порядков величин) углеводородокисляющих бактерий в морских акваториях, загрязненных в результате аварийных разливов нефти и нефтепродуктов.
Гетеротрофные микроорганизмы, которые за счет изменений генотипа адаптировались к повышенным концентрациям органических загрязняющих веществ, в том числе токсичных, приобрели и способность их разрушать. Ориентируясь на современный уровень развития энзимологии и генетики, можно полагать, что в основе адаптации морских микроорганизмов к новым химическим условиям лежит либо индукция новых функционально активных ферментов, либо приобретение бактериями способности к катаболизму новых органических соединений в результате мутаций в структурных или регуляторных хромосомных генах. Механизм использования внехромосомного (плазмидного) резерва генетической информации представляется наиболее вероятным при реализации микробной клеткой адаптационных возможностей.
В настоящее время полагают, что плазмиды биодеградации представляют собой хорошую модель, иллюстрирующую эволюционный потенциал микроорганизмов. При этом существенно, что перенос плазмид между штаммами микроорганизмов играет большую роль в реакции природных популяций микрофлоры на присутствие пестицидов, т.е. определяют активность их микробной трансформации в природной среде (Цыбань, 2000).
Влияние различных химических веществ
Псевдомонады способны приспосабливаться к различным химическим соединениям, могут аккумулировать, либо разлагать их.
Имеется много сведений о культурах бактерий, способных вести расщепление СПАВ, но признанным является утверждение о том, что в наибольшей степени эта способность присуща гетеротрофным грамотрицательным палочковидным бактериям, в первую очередь представителям рода Pseudomonas.
Некоторые штаммы псевдомонад используют для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от тринитротолуола. Штамм PseudomonasalcaligenesBS300 продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию тринитротолуола в водной среде и почве. Известны штаммы микроорганизмов: Pseudomonasfluorescens I-C, Pseudomonassavastanoi, Pseudomonasputida, которые могут разлагать ТНТ в почве и воде(Воробьев и др., 2004).
При незначительной концентрации в воде нитритов (от 0,2 до 2 г/л) сроки выживания в воде бактерий рода Pseudomonas увеличиваются. Концентрации нитритов 20 г/л. наоборот, ингибируют развитие бактерий. Фосфаты увеличивали сроки сохранения бактерий.
Влияние тяжелых металлов
Особое положение тяжелых металлов среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy et al., 1990). Микроорганизмы могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к тяжелым металлам отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).
Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами привело к распространению в почве и воде индустриальных районов микроорганизмов, устойчивых к металлам. Во многих случаях резистентность к тяжелым металлам детерминируется плазмидами (Silver et al.,1988).
Известно, что одним из факторов токсичности катионов тяжелых металлов для бактериальных клеток является нарушение барьерных свойств их цитоплазматическое мембраны (ЦПМ). Изменение барьерных характеристик ЦПМ бактерий, сопровождающееся утечкой внутриклеточного калия и уменьшением электропроводности цитоплазмы, выявляется методом электроориентационной спектроскопии клеток (Иванов, 1996).
Влияние катионов тяжелых металлов и анионного детергента додецилсульфат натрия на барьерные свойства цитоплазматической мембраны Cо-чувствительного штамма PseudomonasputidaBS394 и Со-резистентных, дикого Pseudomonassp. BS501 и трансформанта PseudomonasputidaBS394 (pBS501),содержащих плазмиду pBS501 было исследовано с помощью высокочастотной электроориентационной спектроскопии.
Бухта Киевка вдается в берег между мысом Суткового и мысом Островной. Северозападный и восточный берега бухты высокие, а берег вершины отмел и окаймлен песчаным пляжем. К берегу вершины бухты выходит низменная долина, по которой протекает река Киевка. Берега бухты поросли лесом и кустарником. Река впадает в бухту двумя рукавами, из которых западный является главным. Долина реки в нижнем течении имеет значительную ширину и поросла в основном травой и кустарником.
Вдоль берегов бухты в прибрежной полосе разбросаны островки, скалы, банки и осыхающие рифы.
Глубины на линии входных мысов бухты 14—24 м. Грунт в бухте Киевка преимущественно песок или песок с илом.
Бухта используется для судоходства. Суда становятся на якорь в северо-восточной части.
Бухта Круглая, защищенная от юго-восточных ветров, незначительно вдается в северо-западный берег полуострова Брюса в 1,4 мили к WSW от мыса Брюса. Входные мысы бухты скалистые и обрывистые, к вершине бухты берег понижается и переходит в широкий галечный пляж.
На берегу вершины бухты Круглая расположено селение База Круглая. Постройки селения приметны при подходе к бухте.
Глубины в средней части бухты Круглая 24м, грунт — ил, песок и галька.
На берегу располагается санаторно-оздоровительный комплекс.
Рисунок 1 – Карта-схема районов работ: бухта Золотой Рог, бухта Круглая (1), бухта Киевка (2).
2.2 Материалы
Для исследований были использованы штаммы бактерий рода Pseudomonas разных видов (Ps. cepacia – 133k, 160k; Ps. fluorescence – 1,8, 3,5, 3,6; Ps. malthophyla – 51; Ps. putida – 136k, 145k, 4, 130k, 140k, 577,6), выделенные из морских сред, отличающихся по степени антропогенной нагрузки – бухта Киевка, б. Круглая и б. Золотой Рог.
Микробиологические среды, используемые в работе
Среда для морских гетеротрофных микроорганизмов – СММ (г/л)
